鬼箭羽醇提物對四氯化碳誘導小鼠肝纖維化模型的作用

萬　星，郭　瓊，劉向東，黃德斌

(湖北民族學院1. 醫學院、2. 附屬民大醫院西藥科、3. 附屬民大醫院重癥醫學科，湖北 恩施　445000)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對各種慢性刺激(如病毒感染、藥物誘導、自身免疫等)進行損傷修復反應時，以膠原為主的細胞外基質在肝內大量沉積的病理過程，是所有慢性肝病共同的病理基礎，是各種慢性肝病向肝硬化發展的必經階段[1-2]。目前，臨床并無特異性治療藥物，因此，了解HF的發生發展機制，尋找有效的預防或治療HF的藥物具有重大意義。鬼箭羽(Euonymusalatus，EA)為衛矛科植物衛矛的具翅狀物枝條或翅狀附屬物，具有破血通經、解毒消腫之功效，主要化學成分有生物堿、黃酮類、甾體、三萜等，具有降血糖、抗腫瘤、調節免疫、抗炎、抗氧化作用[3-5]，其中，醇提物顯示出抗菌、抗炎、抗氧化作用[4-5]。HF依賴肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化增殖,且Herrmann等[6]認為，HSC的活化分3階段，前炎癥階段、炎癥階段和后炎癥階段。以炎癥為切入點，結合目前多數報道鬼箭羽醇提物為抗炎部位，我們初次探究了鬼箭羽醇提物對四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導小鼠肝纖維化的作用及機制。

1　材料

1.1實驗動物C57BL/6小鼠，♂，體質量(17±3) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK京2016-0011。

1.2藥品與試劑鬼箭羽中藥購于湖北恩施宏升大藥房(產地：湖北)；CCl4(國藥集團化學試劑有限公司，臨用前溶于橄欖油)；ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α ELISA試劑盒(美國BD公司)；鼠源α-SMA、CollagenⅠ一抗(英國Abcam公司)；β-actin一抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA試劑盒、ECL化學發光劑(美國Thermo公司)；其他化學試劑為國產分析純。

2　方法

2.1鬼箭羽醇提物的制備稱取一定量鬼箭羽中藥材，粉碎，采用10倍量60%的乙醇冷凝回流2次，每次2 h，旋轉蒸發成浸膏狀后，冷凍干燥成粉末，室溫保存，臨用時溶于雙蒸水。

2.2動物分組、造模及給藥為了初步確定藥靶在疾病發生的上游還是下游，并結合文獻將HSC的活化分3階段，初次實驗時，將藥物組分為前期用藥組和后期用藥組，根據文獻報道[5,7]和本次研究的預實驗，每組設低、中、高3個劑量(L:2 g·kg-1，M:4 g·kg-1，H:8 g·kg-1)，80只動物適應性喂養1周后，隨機分8組：正常組(normal)、CCl4模型組(model)、鬼箭羽醇提物低劑量前期組(EAE-L)、中劑量前期組(EAE-M)、高劑量前期組(EAE-H)、鬼箭羽醇提物低劑量后期組(EAL-L)、鬼箭羽醇提物中劑量后期組(EAL-M)、鬼箭羽醇提物高劑量后期組(EAL-H)。模型組小鼠腹腔注射含25% CCl4的橄欖油溶液1.6 mL·kg-1，每周2次，共30 d 9次；EAE組在造模同時，僅1～15 d連續灌胃藥物；EAL組在造模同時，僅16～30 d連續灌胃藥物；正常組全程灌胃等體積的生理鹽水。所有小鼠30 d后禁食不禁水，24 h后處死，按要求保留標本。

2.3血清學指標檢測小鼠眼球采血后，靜置分離血清，按試劑盒說明書測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)，ELISA法測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

2.4肝臟外觀形態觀察及肝指數測定小鼠稱重，眼球采血后，頸椎脫臼處死，取肝臟，用高倍相機在同背景、同視野下，拍攝肝臟外觀。用生理鹽水沖洗肝臟，濾紙吸干，稱肝臟重量，計算肝指數。肝指數/%=肝重(g)/體重(g)×100%。

2.5HE染色肝臟用10%甲醛固定24 h，HE染色時，石蠟切片于二甲苯脫蠟3次，過梯度乙醇各5 min，水洗1 min，蘇木精染色5 min，水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，伊紅染2 s，入乙醇脫水2 min，二甲苯透明、封固、鏡檢。

2.6Masson染色常規脫水包埋，切片脫蠟至水，Harris蘇木精染色10 min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，麗春紅酸性品紅染液染5 min，流水稍洗，磷鉬酸溶液5 min，苯胺藍復染5 min，1%冰醋酸處理1 min，95%乙醇多次脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2.7免疫組織化學檢測α-SMA、CollagenⅠ表達石蠟切片脫蠟至水，高溫高壓修復2 min，冷卻至室溫，轉入TBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶室溫20 min，TBS沖洗3次，每次5 min，10%山羊血清孵育20 min，一抗(α-SMA 1 ∶150，CollagenⅠ 1 ∶600)4℃孵育過夜，次日復溫后，TBS沖洗3次，每次5 min；每張切片滴50 μL二抗，室溫孵育30 min，TBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復染2 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化2 s，溫水返藍，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，封片。

2.8Westernblot檢測α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達稱取肝臟組織100 mg,加1 mL RIPA裂解液勻漿破碎組織，再超聲破碎(超聲時間3 s，間隔10 s，超聲10次)，冰上裂解30 min后，4℃、12 000 r·min-1離心20 min,取上清，BCA法測蛋白濃度后，加5×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，-20 ℃保存。配制10%的分離膠，電泳，電轉移，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(α-SMA 1 ∶3 000，CollagenⅠ 1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗脫，孵二抗(1 ∶80 000)，90 min，洗脫，曝光。

3　結果

3.1EA對肝臟形態和肝指數的影響如Fig 1所示，正常組肝臟呈分布均勻紅褐色，包膜光滑；CCl4組表面彌漫明顯的大小不一的塌陷區，邊緣泛白；鬼箭羽醇提物組減少肝臟表面塌陷區的數量和程度，其中，前期給藥組形態改善較后期給藥組好。Tab 1結果顯示，模型組肝指數高于正常組(P<0.05)，EAE-M、EAE-L、EAL-L 3組較模型組肝指數降低(P<0.05)，同劑量的藥物，前期和后期給藥組間無差異。

Tab1　Effect of EA on liver index (±s, n=10)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel

3.2EA對CCl4誘導的肝纖維化小鼠血清ALT、AST的影響如Fig 2所示，與正常組相比，模型組ALT、AST活性明顯升高(P<0.01)，EA醇提物量效依賴地降低其表達，其中，EAE-L對ALT和AST的作用優于EAL-L(P<0.05)，EAE-M和EAL-M，EAE-H和EAL-H比較，對ALT、AST影響，差異無統計學意義(P>0.05)。

3.3EA對CCl4誘導的肝纖維化小鼠病理形態學的影響Fig 3的HE染色顯示，正常組小鼠肝細胞結構正常；CCl4組肝小葉被破壞，肝細胞不同程度的水腫、結構紊亂、明顯腫脹變形，有點狀、片狀壞死及炎性細胞浸潤；鬼箭羽醇提物前期給藥組較CCl4組，損傷量效依賴地減輕，肝索排列較整齊，肝小葉基本恢復正常，炎性因子減少，水腫無改變；鬼箭羽醇提物后期給藥組較CCl4組，肝小葉破壞和炎性因子浸潤仍然存在，僅表現為破壞程度和數量減少。Masson染色顯示，正常組肝小葉結構正常；CCl4組肝索紊亂，肝細胞水腫，大量膠原沉積，在匯管區之間、匯管區與中央靜脈之間形成纖維間隔，分離原來肝小葉，形成假小葉；鬼箭羽醇提物組仍見壞死以及膠原沉積，肝小葉被破壞，其損傷較CCl4組呈量效依賴地減輕，且低、中劑量鬼箭羽前期給藥組膠原沉積量降低程度明顯優于后期給藥組。

Fig 1　Effect of EA on liver morphology

Fig 2　Effect of EA on activities of ALT, AST(±s, n=10)

Fig 3　Effect of EA on morphology by HE and Masson

3.4EA對小鼠肝組織α-SMA表達的影響α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是HSC活化的標志物。Fig 4的免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組α-SMA升高，EA量效依賴地降低了其表達，同一劑量EAE效果優于EAL。Fig 5的Western blot結果亦提示，模型組α-SMA增高(P<0.05)，EA醇提物能降低其表達(P<0.05)，且同劑量藥物(4 g·kg-1)在前期給藥降低效果明顯(P<0.05)。

3.5EA對小鼠肝組織CollagenⅠ表達的影響肝纖維化是以CollagenⅠ為主的肝臟細胞外基質過度沉積的結果。Fig 6的免疫組化顯示，與正常組比較，模型組CollagenⅠ明顯升高，EA組量效依賴地降低了其表達。Fig 7的Western blot結果亦提示，模型組CollagenⅠ增高(P<0.01)，EA醇提物能降低其表達(P<0.05)，且同劑量藥物(4 g·kg-1)在前期給藥降低效果明顯(P<0.05)。

Fig 4　Effect of EA on α-SMA expression by IHC

Fig 6　 Effect of EA on Collagen Ⅰ expression by IHC

Fig 5　Effect of EA on α-SMA expression by Western blot (±s, n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsEA ethanol extracts group of 4 g·kg-1of later stage

3.6EA對小鼠血清TNF-α水平的影響如Fig 8所示，模型組較正常組TNF-α明顯升高(P<0.01)，EA醇提物呈量效依賴性地降低其表達(P<0.05)，同劑量前期給藥和后期給藥組間無明顯差異(P>0.05)。

4　討論

鬼箭羽史載《神農本草經》，又名衛矛、神箭、六月凌、八樹等，為傳統中藥，全世界有衛矛屬植物220種，我國約有110種，廣泛分布于我國各地[8]。其味甘、澀，無毒，性微寒而堅陰清熱，具有破血通經、解毒消腫、殺蟲之功效[3]。近年臨床用于治療糖尿病、高血脂癥、動脈硬化、類風濕性關節炎效果明顯，民間使用鬼箭羽治療糖尿病取得較好成果[9]，在韓國和日本多用于抗腫瘤[10]。鬼箭羽化學成分復雜，目前國內外報道有黃酮和黃酮苷、強心苷、五環三萜、甾體、有機酸等化合物[11]。據報道，鬼箭羽水提物可降血糖、降血脂[12]，咖啡酸抗腫瘤[13]，鬼箭羽醇提物具有抗菌、抗炎、抗氧化[4-5]等藥理功效。

Fig 7　Effect of EA on Collagen Ⅰ expression by

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsEA ethanol extracts group of 4 g·kg-1of later stage

Fig 8　Effect of EA on TNF-α level

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel

CCl4是一種選擇性肝毒性物質，在肝內通過肝微粒體細胞色素酶P450氧化酶激活后，產生三氯甲基自由基，可引發活性氧自由基的產生和脂質過氧化反應，損傷肝細胞，導致狄氏間隙內HSC活化，釋放Ⅳ型膠原酶降解Ⅳ型膠原，并合成大量Ⅰ型膠原取代Ⅳ型膠原，促使肝纖維化。HSC活化是纖維化發生的中心環節，而臨床上無論病毒感染、藥物作用，還是自身免疫，最終都會經過HSC活化發展成纖維化，若藥物對此經典模型有作用，將有較大臨床意義。本實驗中，鬼箭羽醇提物量效依賴降低肝指數，降低ALT、AST活性，減少致纖維化因子CollagenⅠ分泌和HSC活化標志物[14]α-SMA的生成，顯示出良好的抗肝損傷和阻止纖維化的功能。

根據課題組前期報道，鬼箭羽醇提物有抗炎、抗菌功效[4-5]，本實驗中HE染色的結果顯示，鬼箭羽醇提物減少炎癥細胞的浸潤，結合HSC激活可能與Kuffer細胞、內皮細胞和肝細胞分泌的一些細胞因子，如TNF-α、TGF-β等有關[15]，實驗初步選取了其中一個激活因子TNF-α進行探討。實驗結果顯示，CCl4組較正常組TNF-α分泌增多，鬼箭羽醇提物明顯降低其表達，有趣的是，前期給藥和后期給藥作用差異無統計學意義。因此推測，TNF-α分泌貫穿發病全過程，鬼箭羽醇提物所含不同單體在纖維化發病信號通路上作用階段不同，且TNF-α介導的信號通路可能是一環路，導致不同單體在不同階段對TNF-α都有抑制作用，使得造模前期給藥和后期給藥作用差異無統計學意義。

時效實驗中，多數指標顯示鬼箭羽醇提物前期給藥組抗纖維化的能力要明顯優于后期組，一方面提示臨床越早發現，越早干預為佳；另一方面，課題組推測鬼箭羽醇提物抗纖維化的藥靶可能是纖維化發病機制的上游蛋白。確切的抗纖維化作用及眾多有趣的發現，使我們對鬼箭羽醇提物發揮藥效的具體成份、靶點及作用機制非常感興趣，并將在后期做進一步研究。

(致謝：本實驗在湖北民族學院醫學實驗中心和附屬民大醫院風濕免疫省重點實驗室完成，感謝支持。)

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