下丘腦室旁核Epac蛋白在大鼠炎性痛調節過程中的作用及其機制研究

陳彬彬，黃思婷，花景煜，杜　雷，姬寧寧，宋　昱，章功良，張詠梅

(1. 江蘇省麻醉學重點實驗室，徐州醫科大學麻醉學院，江蘇 徐州　221002；2. 安徽醫科大學基礎醫學院，安徽 合肥　230032)

疼痛是組織損傷或潛在組織損傷所引起的一種不愉快的主觀感受和情感體驗。按照國際疼痛研究學會(international association for the study of pain，IASP)的分類，疼痛包括生理性和病理性疼痛，其中病理性疼痛可進一步分為炎癥性疼痛、神經病理性疼痛和癌性疼痛等。炎癥性疼痛是臨床上最常見的一種癥狀，主要由于周圍組織損傷、缺血、缺氧、酸中毒等引起。目前的研究主要集中在外周組織炎癥反應[1]，外周神經元興奮性增高[2]，中樞興奮性神經遞質大量釋放[3]，以及膠質細胞或炎癥因子敏化[4]等。在炎癥痛中，持續刺激外周傷害性感受器，提高了神經元的興奮性，可以促進背根神經節、脊髓以及相應腦組織痛相關的物質表達[5]。

近年來研究發現，cAMP直接激活的交換蛋白(exchange protein directly activated by cAMP，Epac)在疼痛調節過程中也發揮了重要作用[6]。Epac蛋白是cAMP激活的鳥苷酸交換因子(guanine-nucleotide-exchange factor，GEF)，它可以直接作用于下游小G蛋白Rap蛋白，置換和Rap蛋白結合的GDP為GTP，從而激活Rap蛋白[7]。根據RAPGEF3和RAPGEF4基因編碼，Epac可分為Epac1和Epac2兩種亞型，Epac2根據N端剪輯不同，又可分為Epac2A、Epac2B、Epac2C三種類型[8]。Epac1在全身分布比較廣泛，如中樞神經系統、心臟、血管內皮細胞等；Epac2在全身表達部位比較局限[8]。有研究表明，Epac可以通過下游的Rap1、PKC、MEK/ERK、GRK2等信號分子介導疼痛反應[9]。MEK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激酶，包括MEK1和MEK2兩種亞型，可介導多種生理病理功能，如在大鼠結腸炎腸黏膜通透性[10]以及血管平滑肌細胞增殖[11]中發揮了重要作用。且已有研究表明，在炎癥性疼痛模型中，外周傷害性感覺神經元中表達升高的Epac蛋白可以通過下游MEK/ERK信號通路，直接或間接發揮著傷害性刺激激活神經元的作用[12]。

炎癥性疼痛是一種損傷性應激反應，下丘腦作為神經內分泌調節的重要樞紐站，其中室旁核(paraventricular nucleus，PVN)在應激及疼痛調節中發揮著重要的作用[13]。因此,本研究采用一種常用的動物疼痛模型——完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)誘導的炎性痛模型，采用蛋白質印跡的方法觀察炎癥痛條件下下丘腦室旁核Epac和p-MEK1/2的蛋白表達變化，使用Epac激動劑8p-CPT作用后，觀察其行為學和分子水平改變，為進一步理解炎性痛的發病機制及探討Epac蛋白在炎性痛中的作用提供實驗依據。

1　材料

1.1實驗動物健康成年SD大鼠64只，♂，體質量230～250 g，由山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。大鼠置于晝夜(12 h/12 h)節律光照條件下，室溫(23±1)℃，自由飲水和攝食，所有大鼠實驗前靜養1周。所有實驗均遵守《實驗動物使用規范》。

1.2試劑抗Epac1抗體(Lot：GR29965-14)和抗Epac2抗體(Lot：GR127767-1)均購自Abcam；抗p-MEK1/2抗體(9154S)購自Cell Signaling Technology；抗GAPDH抗體(Cat.No:AC001)購自ABclonal；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；8p-CPT-2′-O-Me-cAMP購自Santa Cruz Biotechnology；CFA購自Sigma；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3儀器熱痛敏刺激儀(IITC series 8-390)購自中國醫學科學院生物工程研究所；機械痛測試儀(ZH)購自淮北立華生物儀器設備有限公司。

2　方法

2.1CFA炎癥性疼痛模型的制備與實驗分組將SD大鼠隨機分為對照組和CFA模型組，每組6只。大鼠固定，用微量注射器吸取100 μL CFA注入大鼠左側后肢足底中心皮下，建立炎癥性疼痛模型；生理鹽水對照組于相同位置注射100 μL生理鹽水。模型建立成功的標志為大鼠局部出現典型的外周炎癥癥狀，包括注射局部紅、腫以及疼痛表現等，持續時間超過1周。首先進行大鼠熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)和機械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold，PMWT)基礎值的測定，此后于足底注射后1、3、5、7、9、11、13 d進行TWL檢測，足底注射后6、8、10、12、14 d進行PMWT檢測。根據行為學以及蛋白檢測結果，在CFA炎癥性疼痛模型建立后，對大鼠進行下丘腦室旁核核團給藥，分為室旁核微量注射生理鹽水組(Saline)和給藥(8p-CPT)組，每組6只，分別PVN微量注射0.3 μL 0.9%生理鹽水或8p-CPT(1 g·L-1)。

2.2下丘腦室旁核核團注射CFA致炎后d 3，大鼠七氟烷吸入麻醉后，將頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨，雙氧水清潔顱骨表面，參考Watson & Paxinos大鼠腦圖譜，結合本課題組對大鼠(230～250) g PVN核團定位摸索，確定核團坐標為：ML=±0.4 mm，AP=-1.4 mm，DV=7.7 mm[13]。用針尖外徑為0.3 mm的微量注射器向核團內注射，1 min內注射完畢，留針5 min以防藥液流出，統一選取右側PVN進行注射。注射后20 min、1 h、2 h檢測熱痛閾。

2.3TWL的測定在同一時間段、同一室溫、同一濕度下進行測定。按照Hargreaves法，將大鼠放置于3 mm厚的15 cm×15 cm×15 cm的有機玻璃箱中，待大鼠在其中適應30 min安靜后，用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側。從照射開始至大鼠出現抬腿回避的時間為TWL；光源刺激強度恒定不變，自動切斷時間為25 s，以防止組織損傷。每只動物連續測定5次，測量間隔3 min，取其中3次比較平穩的數據平均值為大鼠TWL。

2.4PMWT的測定在安靜環境下將大鼠置入透明的有機玻璃箱中，其底為金屬絲制成的網狀格墊。同一時間段，先將大鼠放入箱中，使之適應30 min直至大鼠對陌生環境保持安靜(不在籠里走來走去、不自我舔舐為止)。采用von Frey filaments刺激大鼠左側掌跖部無毛處，Von Frey filaments呈“S”型，作用時間6～8 s，緩慢用力，出現抬足、躲避或舔足動作為陽性反應，每次刺激至少間隔30 s。測量時，選取中間值10.0 g作為起始，若縮足反應為陰性，則選用刺激強度呈對數遞增的相鄰von Frey filaments繼續刺激；若縮足反應為陽性，則選擇相鄰遞減的刺激強度給予刺激。如此反復，以第1個轉折點的前一點為起點，連續6次的刺激結果為最終縮足反應模式。若縮足反應呈持續陽性則為5次刺激，縮足反應呈持續陰性則為4次刺激，刺激次數最多為9次；最大力度為26 g，大于此值時記為26 g，最小力度為4 g，小于此值時記為4 g。采用內推法計算誘發大鼠出現50%機械縮足反應的刺激強度作為機械痛閾，其公式為：50% threshold(g)=(10[Xf+κδ])/10 000(Xf為最后一次刺激強度；κ為不同刺激方式的系數，在內推法的表格中查找；δ為各刺激強度取對數后間距的平均值，δ=0.18)。

2.5Westernblot檢測行為學測試結束后，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后取腦，分離出雙側室旁核。將取出的室旁核放入預冷的裂解液中，在冰上使用電動勻漿器進行勻漿，每個樣本勻漿3次，每次10 s，間隔5 s冷卻，充分裂解后離心15 min，取上清液， BCA法對裂解后的蛋白濃度進行檢測，配平，隨后加入5×上樣緩沖液，放入沸水中煮沸15 min使蛋白變性。用10% SDS～PAGE電泳分離蛋白，通過濕轉方式將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，以相應的檢測蛋白抗體4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜5 min×3次；用堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，再次洗滌，TBST緩沖液洗膜5 min×3次，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色，以Image J軟件進行圖像分析。

3　結果

3.1CFA誘導炎癥性疼痛行為學改變與對照組相比，CFA組的TWL和PMWT基礎值均無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，大鼠左側足底皮下注射CFA后d 1、3、5、7、9、11 TWL明顯降低(P<0.01)，d 13 TWL基本恢復至正常水平(Fig 1A)；注射后d 6、8、10、12 PMWT明顯降低(P<0.05，Fig 1B)。在此過程中大鼠患足伴有紅腫、行走困難、提縮患爪等一系列保護性行為。

3.2CFA炎性痛大鼠下丘腦室旁核Epac1、Epac2和p-MEK1/2蛋白表達情況如Fig 2所示，與對照組相比，CFA炎性痛大鼠下丘腦室旁核Epac1蛋白表達于d 3開始降低，且在d 3和d 9差異有顯著性(P<0.05)，而Epac2蛋白表達則無明顯變化；p-MEK1/2蛋白表達于d 3明顯降低(P<0.05)。

3.3PVN內注射8p-CPT對大鼠痛行為學及p-MEK1/2蛋白表達的影響CFA炎性痛大鼠于d 3，PVN內注射Epac非特異激動劑8p-CPT后，與生理鹽水組相比，8p-CPT組大鼠的TWL明顯升高(P<0.05)，這一效應在給藥后20～30 min達到最大，到2 h衰減到給藥前水平(Fig 3A)。給予激動劑30 min后，室旁核p-MEK1/2蛋白表達較生理鹽水組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；給藥2 h后，室旁核p-MEK1/2蛋白表達基本恢復至給藥前水平(Fig 3B)。

4　討論

Epac蛋白是cAMP下游信號分子，可以介導cAMP多種效應，在中樞神經系統發揮促神經軸突生長[14]、神經遞質釋放[15]、神經元分化與重塑以及突觸傳遞等功能[9]。有研究表明，在外周感覺神經元中Epac蛋白表達升高可促進長時程炎癥性疼痛，通過有效的干預手段使Epac表達恢復正常，可抑制疼痛持續性發展[12]。

Fig 1　Effects of CFA administration on TWL(A) and PMWT(B) in SD rats

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

我們前期的研究發現[13]，幼年經過結直腸擴張應激后可致成年大鼠發生慢性內臟痛敏表現，且這一作用可能和室旁核促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)神經元敏化作用有關，敏化的CRH神經元可分泌大量CRH，并激活其胞膜CRHR1。CRHR1是G蛋白偶聯受體，其被激活時胞內cAMP、Epac、PKA等相關信號分子的表達量或激活情況可能發生改變。在炎癥性疼痛模型中對此相關研究甚少，因此，本實驗采用CFA誘導的炎性痛模型，該模型成功模擬了炎性痛局部紅、腫、熱、痛等癥狀，并且可維持一段時間。結果證實，大鼠CFA致炎后d 1 TWL即降低，直到d 11維持在較低水平，d 13 基本恢復到正常水平，而PMWT于d 14仍維持在較低水平；在d 3室旁核Epac1和p-MEK1/2蛋白表達均降低，并可維持一段時間，這與已有報道致炎后外周感覺神經元Epac蛋白表達水平升高正好相反[2]，這可能與外周和中樞在炎性痛調節過程中分別發揮的不同作用有關，在此過程中，室旁核p-MEK1/2表達可能受到多種上游信號分子影響；而致炎后Epac另一種亞型Epac2蛋白表達在各時間點并無明顯變化，因此，我們認為，在CFA致炎過程可能參與發揮作用的Epac類型是Epac1蛋白。CFA致炎后d 3室旁核注射Epac非特異性激動劑8p-CPT 20～30 min后鎮痛效果最佳，1 h尚具有明顯的鎮痛效果，至2 h基本恢復到給藥前水平，這可能與藥物代謝有關。與生理鹽水組相比，8p-CPT組室旁核p-MEK1/2蛋白表達明顯升高，2 h后8p-CPT組p-MEK1/2蛋白水平恢復至給藥前水平，這和行為學結果相一致。故下丘腦室旁核Epac1-MEK1/2信號通路可能參與了CFA所致的慢性炎癥性疼痛的發展過程。

Fig 2　Expression of Epac1(A), Epac2 (B) and p-MEK1/2(C) in PVN in CFA treated rats

*P<0.05vsbaseline

Fig 3　Changes of TWL(A) and expression of p-MEK1/2 protein(B) after injecting Epac non-specific agonist 8p-CPT-2'-O-Me-cAMP in PVN on 3rd post CFA injection

*P<0.05,**P<0.01vssaline group;##P<0.01vs30 min 8p-CPT group.

綜上所述，我們認為CFA致炎后，于d 3開始進入慢性炎癥期，下丘腦室旁核作為神經內分泌調節中樞，在外周持續性炎癥痛刺激下其功能發生失調，這可能與室旁核神經元發生敏化有關，從而導致室旁核對外周痛刺激反應性增強，其胞內的分子機制可能與下丘腦室旁核Epac1蛋白表達降低有關。降低的Epac1蛋白通過對下游信號分子MEK1/2的激活效應減弱，介導了慢性炎癥性疼痛過程，本研究將為臨床慢性炎性痛的治療提供一定的理論基礎和治療靶點。

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