天麻素在甲基苯丙胺誘導SH-SY5Y細胞自噬中的作用及機制研究

楊根夢，李　娟，洪仕君，薛鳳麟，何永旺，周一卿，曾曉鋒，李利華

(1. 昆明醫科大學法醫學院，云南 昆明　650500；2. 中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，云南 昆明　650118)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一種依賴性極高的新型合成毒品，具有精神依賴性強、復吸率高、神經毒性大等特點,長期濫用具有很強的神經毒性和藥物依賴性。METH的神經毒性主要與中樞神經系統的多巴胺能信號通路相關，影響多巴胺的釋放而導致神經退行性損傷[1]。SH-SY5Y細胞即人神經母細胞瘤細胞，是一種與人類多巴胺能神經細胞具有相似生化特征的細胞株，被廣泛用于中樞神經系統神經毒性的研究[2]。目前METH濫用趨勢嚴重，已成為當今全球最嚴重的公共衛生問題之一。研究表明，自噬參與了METH神經毒性的發生、發展，但自噬在METH神經毒性及其依賴機制中的作用目前尚未完全闡明。

隨著METH依賴機制和戒斷干預研究的不斷深入，尋找戒毒藥物逐漸受到重視。天麻素(gastrodin)是天然中藥天麻的主要化學成分，是天麻活性成分中含量最高的有效單體成分，其具有鎮靜催眠、抗癲癇、鎮痛、抗氧化、抗炎、增強機體免疫力等作用。此外，研究表明，天麻素具有抗自由基和保護細胞膜、抗氧化、凋亡、抑制能量代謝、減少細胞脂肪蓄積以及對多種因素導致的神經元損傷具有保護作用等[3-6]。因此，本研究擬證實METH可誘導SY5Y細胞自噬，并用天麻素進行干預，觀察天麻素在METH誘導SY5Y 細胞自噬中的作用，并初步探討其作用機制。

1　材料

1.1細胞SH-SY5Y細胞株購自國家實驗細胞資源共享平臺。

1.2試劑METH試劑購自中國藥品生物制品檢定所；天麻素購自成都思曼特生物科技有限公司；DEME:F12培養基、胎牛血清(Gibco公司)；LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt抗體(Abcam公司)；β-actin抗體(Sigma公司)；山羊抗兔和抗鼠二抗(CST公司)；BCA蛋白定量試劑盒、Western blot相關試劑(碧云天生物技術研究所)。

1.3儀器超凈工作臺(蘇州凈化公司產品)；CO2恒溫培養箱(美國Thermo Fisher公司);倒置顯微鏡(Nikon)；CT15RE臺式微量高速離心機(Hitachi公司)；Synergy HT酶標儀(美國Bio-Tek公司)；164-5050型Western電泳儀、GelDoc2000型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡)。

2　方法

2.1試劑配制取20 mg METH(分子質量185.7)，加2 mL PBS溶解，過濾除菌，配制成濃度為53.85 mmol·L-1，4℃冰箱保存。取20 mg天麻素(分子質量為286.28)，溶于2 mL PBS中，配制成濃度為83.02 mmol·L-1，4℃冰箱保存。

2.2細胞培養SH-SY5Y細胞用含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM ∶F12 培養基在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每36 h換液1次，待細胞長滿培養板后，通過胰酶消化液消化并進行傳代培養，當培養細胞達到一定數量，且呈現對數生長時待用。根據實驗方案設計加入不同濃度的METH和天麻素。

2.3細胞藥物處理及干預貼壁細胞經胰酶消化制備成單細胞懸液，以4×105～5×105/孔的密度接種于6孔板中，培養36 h后，用METH(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mmol·L-1)處理細胞。通過檢測自噬相關蛋白并結合細胞形態學改變，本研究選擇METH誘導自噬的濃度是2.0 mmol·L-1，提前1 h給予1 mmol·L-1天麻素干預，隨后在顯微鏡下觀察細胞形態學變化，并檢測給藥前后LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt和p-Akt的變化情況。

2.4免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡分析對數生長的細胞經胰酶消化后，接種于鋪有小玻片的24孔板內，當細胞密度達70%～80%時加藥，24 h后棄掉每孔內的培養液，用PBS小心漂洗細胞2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定20 min，漂洗細胞5 min×3次；0.5% Triton-X100穿孔30 min,漂洗細胞5min×3次；5%山羊血清封閉液封閉30 min，漂洗細胞5 min×3次；加入一抗(1 ∶200),4 ℃過夜。漂洗細胞5 min×3次，加入1% BSA稀釋的二抗(1 ∶200)，于37℃雜交1 h，漂洗細胞5 min×3次，5 mg·L-1DAPI染色2 min，漂洗細胞5 min×3次，在載玻片上滴1滴抗淬滅劑，隨后將小玻片倒扣在載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

2.5Westernblot分析棄掉每孔內的培養液，用PBS漂洗細胞2次，6孔細胞培養板中每孔加入100 μL裂解液，于冰上裂解10～20 min后，用細胞刮收集蛋白并移至離心管，于4℃、14 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝，用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白混合5×蛋白上樣緩沖液，在沸水浴中煮10 min進行蛋白變性。SDS-PAGE電泳，半干電轉移法將蛋白轉至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗(1 ∶1 000)，4℃過夜，TBST洗膜10 min×4次，滴加二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，用ECL顯色液激發化學發光，曝光，β-actin作為內參。應用Image J軟件對Western blot條帶進行灰度值比較。

3　結果

3.1METH處理24h后細胞形態學變化如Fig 1所示，隨著METH濃度的增加，SY5Y細胞胞體逐漸萎縮變圓，突起逐漸變短、消失，同時部分細胞質內可見大小不等的散在性空泡結構形成。當METH濃度達3 mmol·L-1時，可見SY5Y細胞失去原形，不貼壁，呈漂浮狀態。天麻素干預后，細胞折光性增強，胞質內空泡結構減少，部分細胞形態發生變化。

3.2METH對SY5Y細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表達的影響如Fig 2所示，與對照組相比，SY5Y細胞LC3-Ⅱ表達水平隨著METH濃度的增加逐漸增強，Beclin-1表達水平升高(P<0.05，P<0.01)。提示METH可誘導SY5Y細胞自噬。

3.3不同時間點METH對SY5Y細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1表達的影響如Fig 3所示，在不同時間點(6～48 h)給予2 mmol·L-1METH處理SY5Y細胞，24 h后LC3II和Beclin-1水平升高最明顯。

3.4天麻素干預前后LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達情況Fig 4結果顯示，天麻素+METH組LC3-Ⅱ的表達水平比METH組有所降低。與對照組相比，METH組LC3-Ⅱ和Beclin1表達水平明顯增強(P<0.01)；與METH組相比，給予天麻素干預后， LC3-Ⅱ和Beclin1表達水平降低(P<0.05,P<0.01)，說明天麻素對METH誘導的SY5Y細胞自噬有抑制作用。

3.5天麻素干預前后SY5Y細胞Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR表達情況如Fig 5、6所示，METH處理SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，mTOR和Akt表達差異無顯著性，p-mTOR、p-Akt表達水平明顯降低(P<0.01)，說明METH誘導SY5Y細胞自噬與其減弱p-mTOR和p-Akt的表達水平有關。與METH組相比，天麻素干預后，mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表達水平升高(P<0.05,P<0.01)。說明天麻素通過增強Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達水平，發揮抑制METH誘導SY5Y細胞自噬的作用。

Fig 1　Morphological changes of SY5Y cells by METH and gastrodin treatment for 24 h

A: Control; B: 0.5 mmol·L-1METH; C: 1.0 mmol·L-1METH; D: 1.5 mmol·L-1METH; E: 2.0 mmol·L-1METH; F: 2.5 mmol·L-1METH; G: 3.0 mmol·L-1METH; H: 1 mmol·L-1Gastrodin; I: 1 mmol·L-1Gastrodin+2.0 mmol·L-1METH

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 3　Effect of METH on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells at different time points detected by Western blot

The levels of LC3-Ⅱ and Beclin-1 increased time-dependently with a significant rise at 24h.This time point was used in all subsequent experiments.*P<0.05,**P<0.01vs6 h.

Fig 4　Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells detected by Western blot(A) and confocal microscope(B)**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs METH group

Fig 5　Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of Akt(A) and p-Akt(B) in SY5Y cells detected by Western blot

4　討論

Fig 6　Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of mTOR and p-mTOR in SY5Y cells detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMETH group

自噬對細胞內異常蛋白質的降解和細胞器的更新具有十分重要作用，能夠提高細胞對周圍環境的適應性，對于抗腫瘤治療以及維持營養缺乏狀態下細胞的代謝功能不可或缺[7]。但是過度自噬卻是細胞程序性死亡的一種方式[8]。在中樞神經系統中，自噬是把雙刃劍，自噬功能的紊亂使神經元對興奮性毒性更加敏感[9]。近年來研究表明，自噬參與了METH神經毒性作用，METH與自噬的研究雖然已取得一定的進展，但METH濫用與自噬之間確切的作用機制和信號通路仍不清楚。

本研究發現，隨著METH濃度的增加，SY5Y細胞胞體逐漸萎縮變圓，突起逐漸變短、消失，同時部分細胞質內可見大小不等的散在性空泡形成。當METH濃度達3 mmol·L-1時，細胞失去原形，不貼壁呈漂浮狀態。說明METH對SY5Y細胞具有一定的毒性作用，同時可誘導細胞質內大量類似自噬泡結構的形成。2 mmol·L-1METH處理SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達明顯增強，說明METH可誘導SY5Y細胞自噬，且METH處理24 h后自噬發生最明顯。研究表明，METH可明顯誘導神經細胞自噬，METH濫用可使機體產生大量活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，并破壞線粒體功能，從而誘導細胞死亡。同時，線粒體功能障礙可增加患神經退行性疾病的風險[10]。

隨著METH濫用的嚴重性和影響性，藥物戒毒治療的研究逐漸受到重視。針對METH神經毒性治療方面，研究表明，褪黑素、?；撬峒癗-乙酰半胱氨酸(NAC)等抗氧化藥物對METH誘導的神經毒性和自噬具有保護作用[11]。本研究選擇云南天然藥物天麻素，探討天麻素在甲基苯丙胺誘導SY5Y細胞自噬中的作用及其作用機制。本研究發現，天麻素干預后，細胞折光性增強，部分細胞形態發生變化，胞質內空泡結構減少。給予2 mmol·L-1METH處理前1 h加入1 mmol·L-1天麻素，與對照組相比，天麻素組表達LC3-Ⅱ差異無顯著性，Beclin-1表達水平稍升高。與METH組相比，天麻素+METH組LC3-Ⅱ和Beclin-1表達水平均明顯降低，說明天麻素可減弱METH誘導的SY5Y細胞自噬，對METH誘導的SY5Y細胞自噬有一定的抑制作用。

mTOR是調節自噬的負調控因子，當機體處于饑餓狀態和產生大量ROS時， mTOR的活性被抑制而激發自噬。研究表明，ERK、JNK、p38 MAPK信號通路和Beclin1/Bcl-2復合物、Beclin1-ClassⅢPI3K等參與了自噬的調節[12-14]。PI3K-Akt-mTOR信號通路是調節自噬的經典信號通路，被證實參與了阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)與帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)動物模型的發病過程[15]。PI3K-Akt能夠調節下游mTOR活性，mTOR為自噬的重要調節蛋白[16]。研究表明，天麻素能夠通過抑制LPS誘導的星形膠質細胞過度自噬，發揮保護作用，其保護作用與天麻素調控凋亡相關的Bcl-2、Bax表達及自噬相關的PI3K-Akt-mTOR、p38 MAPK信號通路密切相關[9]。因此，本研究檢測了天麻素干預前后Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達情況。結果發現，2 mmol·L-1METH處理SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，p-mTOR和p-Akt表達水平明顯降低，然而，mTOR和Akt表達無明顯差異，說明METH誘導SY5Y細胞自噬與其減弱p-mTOR和p-Akt的表達水平有關。提前1 h給予1 mmol·L-1天麻素干預后，與METH組相比，天麻素+METH組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達水平均升高,說明天麻素通過增強Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達水平，發揮抑制METH誘導SY5Y細胞自噬的作用。

由于METH神經毒性戒斷藥物的研究目前尚處于起步階段，本實驗通過研究天麻素在METH誘導SY5Y細胞自噬中的作用及機制，揭示了天麻素對METH誘導的SY5Y細胞自噬具有一定的抑制作用，其機制與天麻素調控Akt和mTOR信號通路密切相關。本研究可為METH濫用者提供治療的新策略，同時也為中藥的研發奠定基礎。

(致謝：本實驗是在中國醫學科學研究院生物研究所實驗動物中心和昆明醫科大學法醫學院實驗室完成的，對為本實驗辛勤付出的老師和同學表示衷心的感謝)。

參考文獻：

[1]Li X,Wang H,Qiu P, et al. Proteomic profiling of proteins associaated with methamphetamine-induced neurotoxicity in different regions of rat brain[J].NeurochemInt,2008,52(1-2): 256-64.

[2]Rabelo T K, Zeidan-chulia F, Vasques L M,et al. Redox characterization of usnic acid and its cytotoxic effect on hunman neuron-like cells(SH-SY5Y)[J].ToxicolInVitro,2012,26(2):304-14.

[3]陳維紅,羅棟.天麻素、天麻多糖藥理作用研究進展[J].中國藥物評價,2013,30(3):132-4,141.

[3]Chen W H, Luo D. Research development on pharmacological action in Gastrodia elata blume and Gastrodia elata polysaccharide[J].ChinJDrugEval,2013,30(3):132-4,141.

[4]耿雅娜,于濱,孔維佳.天麻素通過激活AMPK通路減少油酸誘導的HL-7702細胞脂肪蓄積[J].中國藥理學通報,2015,31(1):39-44.

[4]Geng Y N, Yu B, Kong W J. Gastrodin ameliorates oleic acid-induced fat accumulation through activation of AMPK pathway in HL-7702 cells [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(1):39-44.

[5]趙燕玲,張博愛,賈延劼,等.天麻素對海人酸致大鼠大腦皮質神經元損傷的保護作用[J].中國實用神經疾病雜志,2009,12(5):33-6.

[5]Zhao Y L, Zhang B A ,Jia Y J, et al. Protective effects of gastrodine on injured rat cerebral neurons by KA[J].ChinJPractNervousDis,2009,12(5):33-6.

[6]李海龍,栗艷,厚榮榮,等.天麻素對百草枯和代森錳誘導的小鼠腦黑質多巴胺能神經元損傷作用[J].成都中醫藥大學學報,2010,33(1):57-9.

[6]Li H L, Shu Y, Hou R R,et al. Neuroprotective effects of gastrodin on PQ and MB induced dopaminergic neurons damage in C57BL mice[J].JChengduUnivTCM,2010,33(1):57-9.

[7]Meijer A J,Codogno P. Autophagy: regulation and role in disease[J].CritRevClinLabSci, 2009,46(4):210-40.

[8]Button R W, Luo S, Rubinsztein D C. Autophagic activity in neuronal cell death[J].NeurosciBull,2015,31(4):382-94.

[9]Wang X S, Tian Z, Zhang N,et al. Protective effects of gastrodin against autophagy-mediated astrocyte death[J].PhytotherRes, 2016,30:386-96.

[10] Van L S, Berman S B. Mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease[J].ExpNeurol, 2009,218:247-56.

[11] 楊根夢,陳遜,曾曉鋒.甲基苯丙胺誘導神經細胞自噬的研究進展[J]. 中國藥理學通報, 2016,32(10):1341-4.

[11] Yang G M ,Chen X, Zeng X F. Research progress of methamphetamine inducing nerve cell’s autophagy[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(10):1341-4.

[12] Pattingre S, Tassa A, Qu X,et al.Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy[J].CellDeathDiffer,2005,122:927-39.

[13] Chu C T, Zhu J, Dagda R. Beclin 1-independent pathway of damage-induced mitophagy and autophagic stress: implications for neurodegeneration and cell death[J].Autophagy,2007,3:663-6.

[14] Tang G,Yue Z,Talloczy Z,et al. Autophagy induced by Alexander disease-mutant GFAP accumulation is regulated by p38/MAPK and m TOR signaling pathways[J].HumMolGenet,2008,17(11):1540-55.

[15] Heras-Sandoval D,Pérez-Rojas J M,Hernández-Damián J,et al. The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration[J].CellSignal,2014,26(12):2694-701.

[16] Hu Z P,Yang B B,Mo X Y, et al. Mechanism and regulation of autophagy and its role in neuronal diseases[J].MolNeurobiol,2015,52(3):1190-209.