麥芽品種DNA指紋圖譜構(gòu)建的研究

張志軍,岳 杰,尹 花,余俊紅,董建軍,周月南

(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島啤酒股份有限公司,山東青島 266100)

啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料,經(jīng)酵母發(fā)酵釀制而成的飽含二氧化碳的低酒精度酒。麥芽作為啤酒的主要原料,是大麥經(jīng)浸麥、發(fā)芽、干燥和焙焦等工藝制得的,麥芽的質(zhì)量直接決定啤酒的品質(zhì)。不同麥芽品種彼此間釀造特性不同,如浸出率、糖化力、粘度等,釀造工藝必須根據(jù)麥芽品種的特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。因此麥芽品種鑒定是評(píng)價(jià)麥芽質(zhì)量的重要指標(biāo),也是啤酒企業(yè)在商業(yè)麥芽采購中極為關(guān)注的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

目前大麥品種鑒定技術(shù)既有傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別方法、田間小區(qū)種植鑒定,也有蛋白質(zhì)電泳鑒別方法和DNA分子標(biāo)記法。田間小區(qū)種植鑒定被認(rèn)為是鑒定品種真實(shí)性和測定品種純度最為可靠、準(zhǔn)確的方法,但該法鑒定周期長，氣候、土壤等條件要求高[1]。Draper[2]認(rèn)為大麥種子醇溶蛋白SDSPAGE電泳圖譜可作為品種的生化“指紋”,用于大麥品種真實(shí)性和純度的鑒定。林艷等[3]開發(fā)了啤酒大麥種子醇溶蛋白SDSPAGE電泳方法,利用GelPro軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行條帶分析和比較,建立了每個(gè)品種的蛋白質(zhì)“指紋”,組成加拿大啤酒大麥品種標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫,但SDSPAGE法存在分辨率低、鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確的問題[4]。游麗華等[5]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜,成功鑒定出7個(gè)特異蛋白點(diǎn)和34個(gè)共同蛋白點(diǎn),基于蛋白質(zhì)點(diǎn)構(gòu)成了3種澳大利亞啤酒大麥的蛋白標(biāo)志物庫。Scobie等[6]從大麥中提取儲(chǔ)藏蛋白,利用MALDI-TOF質(zhì)譜分析大麥蛋白質(zhì)圖譜,可對(duì)西澳種植的大麥品種進(jìn)行快速鑒定。然而大麥經(jīng)發(fā)芽、干燥后外觀特征已發(fā)生變化,且醇溶蛋白在蛋白酶的作用下分解,因此麥芽品種鑒定已不適用于傳統(tǒng)的大麥形態(tài)鑒別法和SDSPAGE蛋白質(zhì)電泳鑒定法。浸出率、糖化力、庫爾巴哈值等現(xiàn)有麥芽指標(biāo)均是反映麥芽混合狀態(tài)的平均值,無法體現(xiàn)麥芽到底是單品種構(gòu)成還是多品種混合組成的具體特征。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)和利用,DNA指紋圖譜逐漸成為鑒定種子真實(shí)性的重要方法。DNA指紋圖譜法主要依靠AFLP、RAPD、SSR和SNP等類型的DNA分子標(biāo)記來構(gòu)建不同品種的指紋圖譜,然后利用具有多態(tài)性的標(biāo)記進(jìn)行種子真實(shí)性檢測。Xue等[7]利用DNAAFLP技術(shù)對(duì)27種國產(chǎn)及進(jìn)口大麥品種進(jìn)行鑒定。Pattemore等[8]基于MALDI-TOF質(zhì)譜分析從澳麥品種的45個(gè)遺傳位點(diǎn)中選出33個(gè)信息位點(diǎn)得到唯一的SNPs條形碼,可高效區(qū)分澳大利亞的35個(gè)啤麥和飼料大麥品種。麥芽中富含多糖、多酚、氨基酸等物質(zhì),與大麥相比麥芽DNA的分離純化難度更大。更為關(guān)鍵的是麥芽經(jīng)84～86 ℃高溫焙焦2～3 h后DNA鏈容易斷裂和降解[9],進(jìn)而影響PCR的擴(kuò)增效果。

簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat,SSR),又稱微衛(wèi)星,是一類由1～5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列[10]。微衛(wèi)星在植物基因組中非常豐富,同一類微衛(wèi)星可分布于整個(gè)基因組的不同位置上。每個(gè)座位上重復(fù)單位的數(shù)目乃至重復(fù)單位的序列都有可能不同,因而造成了每個(gè)座位上的多態(tài)性,這種多態(tài)性的信息量是比較高的。由于每個(gè)微衛(wèi)星DNA兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列,因而可根據(jù)其兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,通過PCR擴(kuò)增獲得簡單序列重復(fù)的多態(tài)性。作為第二代分子標(biāo)記技術(shù),微衛(wèi)星標(biāo)記能更好的鑒定物種,已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在植物物種多樣性和品種鑒定上,包括大麥[1116]、小麥[1720]等。谷方紅等[9]從46對(duì)SSR引物中篩選到5個(gè)多態(tài)性較豐富的引物,可區(qū)分實(shí)驗(yàn)的8個(gè)大麥及麥芽品種。Lin[21]等利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行大麥品種鑒定,基于4對(duì)SSR引物建立17種大麥品種的等位基因檢索系統(tǒng)。Southworth[22]基于毛細(xì)管電泳構(gòu)建6對(duì)SSR熒光引物反應(yīng)體系,可區(qū)分大多數(shù)已注冊(cè)的英國大麥品種。Amani等[23]利用11個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)31個(gè)北非六棱大麥品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析。

本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)21份進(jìn)口及國產(chǎn)大麥麥芽品種的多樣性進(jìn)行研究,構(gòu)建麥芽品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫,為啤酒企業(yè)采購商業(yè)麥芽提供可靠的品種鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

21個(gè)啤酒大麥品種 包括5個(gè)加拿大大麥、9個(gè)澳大利亞大麥、3個(gè)法國大麥和4個(gè)國產(chǎn)大麥,品種名稱及產(chǎn)地見表1,對(duì)上述大麥品種進(jìn)行微制麥,得到相應(yīng)的麥芽樣品,微制麥條件,14 ℃浸麥44 h,15 ℃發(fā)芽4 d,45～70 ℃干燥5 h,84 ℃焙焦3 h,冷卻后去根處理,4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ参顳NA提取試劑盒 德國Qiagen公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs 美國Thermo Fisher公司;30%(w/v)丙烯酰胺溶液、5×TBE緩沖液、過硫酸銨、四甲基乙二胺、DNA Marker 生工生物工程(上海)股份有限公司;引物 由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 大麥品種名稱列表Table 1 List of barley cultivars used

PCR儀、PAC3000型電泳儀 美國BioRad公司;離心機(jī) 德國Sigma公司;高通量組織研磨儀 北京托摩根公司;紫外分光光度計(jì) 美國GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品DNA的提取 取單粒麥芽樣品于2.0 mL離心管中,加入8 mm鋼珠一顆,高通量組織研磨儀1200 r/min粉碎1 min,利用Qiagen植物DNA試劑盒進(jìn)行提取。提取的DNA用TE溶解,并用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)測定所提DNA的純度與濃度。將各材料DNA濃度稀釋到20 ng/μL作為PCR反應(yīng)體系的模板,置于20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物合成及反應(yīng)條件 根據(jù)相關(guān)報(bào)道[2425],從大麥7條染色體中選擇105對(duì)SSR引物,以8個(gè)麥芽品種的DNA為模板,每對(duì)引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次,PCR反應(yīng)體積20 μL,含MgCl22.5 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,正向引物、反向引物各0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0單位,1×PCR緩沖液4 μL(不含Mg2+),樣品DNA 20 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 產(chǎn)物分離 擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上110 V恒壓電泳分離2 h,最后用硝酸銀法進(jìn)行染色[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)一個(gè)給定的SSR引物,不同的品種會(huì)同時(shí)存在幾個(gè)等位基因,根據(jù)等位基因的大小,最小的定為1,然后根據(jù)分子量的大小依次定位為2、3、4等[21],擴(kuò)增片段的分子量大小根據(jù)DNA Marker確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

從21種麥芽中選擇8個(gè)來自各國的代表性品種,對(duì)7條染色體中選擇的105對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性分析,綜合考慮引物鑒別能力、擴(kuò)增效果及染色體分布情況,選擇多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物作為初篩引物。根據(jù)引物擴(kuò)增的穩(wěn)定性及多態(tài)性,初篩得到6對(duì)帶型清晰、重復(fù)性好的SSR多態(tài)性引物,詳見表2。

表2 引物名稱及序列信息Table 2 Primer sequences and chromosome locations

2.2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用這6對(duì)初篩引物直接對(duì)21種麥芽樣品進(jìn)行位點(diǎn)多態(tài)性分析。從聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中選擇擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶作為等位基因位點(diǎn)用于品種多樣性分析。結(jié)果表明,6對(duì)引物共檢測出35個(gè)等位基因,每對(duì)引物的等位基因3～10個(gè)不等,平均每個(gè)引物產(chǎn)生5.83個(gè)等位基因,具有良好的多態(tài)性。其中,位點(diǎn)HVM68多態(tài)性最豐富,在160～300 bp之間包括10個(gè)等位基因,見圖1;位點(diǎn)scssr03907多態(tài)性其次,在150～200 bp之間含有8個(gè)等位基因;位點(diǎn)scssr07759在180～220 bp之間含有4個(gè)等位基因,見圖2;位點(diǎn)scssr10148多態(tài)性最低,在180～270 bp僅含有3個(gè)等位基因。這些位點(diǎn)等位基因數(shù)量豐富,適用于品種的基因分型,有利于麥芽品種之間的指紋識(shí)別和品種區(qū)分。

圖1 引物HVM68對(duì)21種麥芽樣品的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplifications of 21 cultivars using primer HVM68注:1～21:Copeland,Newdale,Flagship,Buloke,港啤,Metcalfe,Hindmarsh,Sloop,Cervoise,甘啤4號(hào),墾啤7號(hào),Gairdner,Vlamingh,,Commander,Kendall,Meredith,Baudin,單二,Hamelin,Sebastian,Prestige。

圖2 引物scssr07759對(duì)21種麥芽樣品的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplifications of 21 cultivars using primer scssr07759注:M:DNA Marker,1～21:Metcalfe,Newdale,Kendall,Baudin,Gairdner,Hindmarsh,Buloke,Sloop,Prestige,Meredith,Vlamingh,Sebastian,Commander,Copeland,Hamelin,Flagship,Cervoise,甘啤4號(hào),墾啤7號(hào),單二,港啤。

利用6對(duì)SSR引物,可對(duì)本研究實(shí)驗(yàn)的21種麥芽中的7個(gè)品種進(jìn)行直接區(qū)分,如位點(diǎn)scssr07759的等位基因3可將Sloop與其它品種區(qū)分開;位點(diǎn)scssr03907的等位基因可直接區(qū)分Baudin、Prestige和甘啤4號(hào);位點(diǎn)Bmag0120的等位基因5可將Vlamingh和其它品種區(qū)分開;位點(diǎn)HVM68可直接區(qū)分Meredith、Hamelin、Sebastian和港啤4個(gè)品種。

2.3 DNA指紋圖譜的建立

根據(jù)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳上的相對(duì)位置,對(duì)每個(gè)引物的等位基因帶型用阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào),將每個(gè)品種指紋圖譜所對(duì)應(yīng)的編碼按特定的引物順序排列起來,就構(gòu)成了代表各品種身份的特征指紋代碼,如在6對(duì)引物下加麥Copeland指紋代碼為351128,澳麥Gairdner的指紋代碼為334845。綜合擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜和等位基因編碼,就構(gòu)成了每個(gè)麥芽品種的指紋圖譜庫,以此作為判定麥芽品種真實(shí)性的重要依據(jù)。本研究利用6對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物可準(zhǔn)確鑒別的21個(gè)麥芽品種,各麥芽品種的特征指紋代碼見表3。如檢測某麥芽是否是加麥Metcalfe,可先用6對(duì)多態(tài)性引物對(duì)待測麥芽樣品和對(duì)照Metcalfe的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色,利用DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)待測麥芽的帶型進(jìn)行分析,將帶型所對(duì)應(yīng)的代碼按引物順序排列起來,與指紋數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)麥芽Metcalfe的指紋代碼和電泳圖譜進(jìn)行比對(duì),即可直觀的判定出待測樣品是否是Metcalfe,從而實(shí)現(xiàn)麥芽品種真實(shí)性的判斷。

表3 21種麥芽等位基因分析Table 3 The alleles detected for 21 malt varieties

表4 21種麥芽品種區(qū)分的等位基因組合Table 4 An allelebased combination for identification of 21 malt varieties

2.4 麥芽品種的區(qū)分

21個(gè)麥芽品種中,利用HVM68和scssr07759位點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)14種麥芽的彼此區(qū)分,增加scssr03907位點(diǎn)后可區(qū)分品種增加到20種。眾多位點(diǎn)中HVM68多態(tài)性最豐富,包括10個(gè)等位基因,可將21種麥芽分成10類,如利用等位基因5可將澳麥Commander和Gairdner與其它品種區(qū)分開,結(jié)合scssr07759位點(diǎn)可完全區(qū)分這兩個(gè)品種。因此,僅需要4對(duì)核心引物(HVM68、scssr07759、scssr03907和Bmac0030)的組合就可以實(shí)現(xiàn)21個(gè)麥芽品種的區(qū)分。研究表明,不同品種麥芽的等位基因的差異不一,同一國家的某些品種較為接近,加麥Metcalfe和Meredith在4個(gè)位點(diǎn)上等位基因完全一致,同為國產(chǎn)大麥的單二和港啤在4個(gè)位點(diǎn)上等位基因也完全一致。而加麥Metcalfe與澳麥Hindmarsh在兩個(gè)多態(tài)性最豐富的位點(diǎn)HVM68和scssr07759上也完全一致,分別為7415和7414,需要4個(gè)位點(diǎn)組合才能完全區(qū)分。但隨著麥芽品種范圍的擴(kuò)大,6對(duì)引物組合的鑒定能力可能會(huì)逐漸降低,某些品種間的指紋圖譜可能完全相同,就需要增加引物組合的數(shù)量來提高品種間的區(qū)分能力。因此引物篩選中得到的其它多態(tài)性SSR位點(diǎn),可作為擴(kuò)展引物提高方法的準(zhǔn)確性,也為識(shí)別其它麥芽品種提供了更多選擇。

3 結(jié)論

使用核心引物組合法進(jìn)行麥芽品種DNA指紋圖譜分析,從105對(duì)SSR引物中篩選到6對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物,每對(duì)引物的等位基因3～10個(gè)不等,平均每個(gè)引物產(chǎn)生5.83個(gè)等位基因。利用6對(duì)多態(tài)性豐富的SSR構(gòu)建21個(gè)麥芽品種的指紋數(shù)據(jù)庫,僅需4對(duì)核心引物就可以實(shí)現(xiàn)21個(gè)麥芽品種的區(qū)分,該法檢測成本低,簡單方便。

本課題以麥芽為研究對(duì)象,構(gòu)建國內(nèi)啤酒企業(yè)使用的主要麥芽品種的指紋數(shù)據(jù)庫,在分子水平上給每個(gè)品種一個(gè)能準(zhǔn)確表明其身份的指紋信息,實(shí)現(xiàn)主要麥芽品種的真實(shí)性鑒定,為啤酒企業(yè)的麥芽采購提供技術(shù)支持。

[1]國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì). GB/T 3543.51995. 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1996:6.

[2]Draper SR. ISTA variety committee report of the working group for biochemical tests for cultivar identification[J]. Seed Sci &Technol,1987,15:431434.

[3]林艷,梅承芳,董建軍,等.利用蛋白質(zhì)“指紋”技術(shù)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(6):97100.

[4]Crank J. The mathematics of diffusion[M]. UK:Oxford University Press,1975:4753.

[5]游麗華,李曉敏,王迎新,等.利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(13):282287.

[6]Scobie M,Jones MG. Identification of barley varieties by protein profiling[M]. Springer:Genetics and Improvement of Barley Malt Quality,2010:99112.

[7]Xue Y C,Chu L. A rapid identification of barley varieties using DNAAFLP[J]. Journal of the Institute of Brewing,2015,121(4):496501.

[8]Pattemore JA,Rice N,Marshall DF,et al. Cereal variety identification using MALDITOF mass spectrometry SNP genotyping[J]. Vournol Cereal Science,2010,52(3):356361.

[9]谷方紅,李海峰,張五九,等.采用微衛(wèi)星技術(shù)進(jìn)行大麥及麥芽的品種鑒定[J]. 啤酒科技,2005(11):2629.

[10]Romero C,Pedryc A,Munoz V. Genetic diversity of diferent apricot geographical groups determined by SSR markers[J]. Genome,2003,46(2):24425.

[11]Russell J R,Fuller J,Young G,et al. Discrimination between barley genotypes using microsatellite markers[J]. Genome,1997,40(4):442450.

[12]Karakousis A,Barr A R,Chalmers K J,et al. Potential of SSR markers for plant breeding and variety identification in Australian barley germ plasm[J]. Australian Journal of Agricultural Research,2003,54(11):11971210,2003.

[13]William M,Dorocicz I,Kasha K J. Use of microsatellite DNA to distinguish malting and nonmalting barley cultivars[J]. Journal of the America Societly of Btewing Chemists,1997,55:107111.

[14]Florian M. An application of kernel methods to variety identification based on SSR markers genetic finger printing[J]. Martin BMC Bioinformatics,2011,12(1):17.

[15]劉志敏,金能,呂超,等. 大麥種質(zhì)資源的SSR遺傳多樣性分析[J]. 麥類作物學(xué)報(bào),2011,31(5):839846.

[16]張赤紅,張京. 大麥品種資源遺傳多樣性的SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)[J]. 麥類作物學(xué)報(bào),2008,28(2):214219.

[17]Manifesto M M,SchlatterAR,Hopp H E,et al. Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers[J]. Crop Science,2001,41(3):682690.

[18]Prasad M,Varshney R K,Roy J K,et al. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism,genotype identification and genetic diversity in wheat[J]. Theoretical Applied Genetics,2000,100(34):584592.

[19]Prasad M,Varshney R K,Kumat A,et al. A microsatellite marker associated with a QTL for grain protein content on chromosome arm 2DL of bread wheat[J]. Theoretical Applied Genetics,1999,99(2):341345.

[20]李莉莉,王俊峰,顏廷進(jìn),等.基于SSR標(biāo)記的山東省小麥DNA指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào),2013,14(3):537541.

[21]Lin Y,Liao M J,Yang G P,et al. Identification of barley varieties used in beer production by microsatellite dna markers[J]. American Society of Brewing Chemists,2007,65(1):4751.

[22]Southworth C L. Barley Variety Identification Using SSRs[M]. Springer:Plant Pathology,2008,27:309317.

[23]Amani B,Ramzi C,Mouldi E,et al. Genetic diversity analysis of North Africas barley using SSR markers[J]. Genetic Engineering and Biotechnology,2012(10):1321.

[24]Liu Z W,Biyashev R M,Saghai M A. Development of simple sequence repeat DNA markers and t heir integration into a barley linkage map[J]. Theoretical Applied Genetics,1996(93):869876.

[25]Ramsay L,Macaulay M,Ivanissevich,S D,et al. A simple sequence repeatbased linkage map of barley[J]. Genetics,2000(156):19972005.

[26]Bassam B J,CaetanoAnolles G,Gresshoff P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J]. Analytical Biochemistry,199l(196):8083.