凝結(jié)芽孢桿菌13002的益生特性

金 迅,劉冬梅,阮 暉

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

益生菌是指能通過改善腸道微生物菌群落平衡而對機(jī)體健康有促進(jìn)作用的微生物制品或其它物質(zhì)[1]。其益生特性主要包括:無毒、無害,安全無副作用;具有改善機(jī)體內(nèi)菌群平衡的能力;對體內(nèi)抑制因素、不良環(huán)境具有抵抗力;可以分泌消化酶類和抑菌物質(zhì);具有較高穩(wěn)定性和臨床有效性,能用于大量生產(chǎn)[23]。益生菌因其益生特性被廣泛應(yīng)用于保健、醫(yī)藥、食品等眾多行業(yè)。

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)為革蘭氏陽性兼性厭氧菌,菌體呈桿狀,芽孢端生,無鞭毛。最適生長溫度為40～50 ℃,最適生長pH為6.6～7.0,具備諸多益生菌的優(yōu)點(diǎn)[47]。從工業(yè)生產(chǎn)的角度講,凝結(jié)芽孢桿菌屬嗜溫菌,能在較高溫度下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),既降低了培養(yǎng)環(huán)境為適應(yīng)菌株正常生長需要降溫帶來的能源和成本損耗,也降低了雜菌污染的可能性。

凝結(jié)芽孢桿菌非人體腸道固有微生物。進(jìn)入人體后,其益生特性主要體現(xiàn)在三個方面:促進(jìn)機(jī)體消化、調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡及改善機(jī)體免疫功能[89]。凝結(jié)芽孢桿菌可通過促進(jìn)消化酶分泌、自產(chǎn)多種代謝物質(zhì)、降解高分子化合物等方式促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。ASOKANS等[10]研究表明凝結(jié)芽孢桿菌能在較大的溫度和pH范圍內(nèi)產(chǎn)生蛋白酶。另外,凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)入腸道之后能通過消耗游離氧,抑制大部分需氧型致病菌的生長,促進(jìn)腸道微生物菌群平衡[11]。Czaczyk等[12]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌對鐮刀菌屬病原真菌及麥角固醇類物質(zhì)的合成具有一定的抑制作用。眾多研究表明,凝結(jié)芽孢桿菌能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞分泌和吞噬能力,加快免疫器官的成熟,調(diào)控細(xì)胞因子分泌,誘導(dǎo)NK細(xì)胞表達(dá)[13]。

近年來,凝結(jié)芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于水生動物、禽畜類、臨床等多個方面[14]。王彥波等[15]指出凝結(jié)芽孢桿菌能夠減緩水體富營養(yǎng)化,增強(qiáng)對病原微生物抗藥性;趙必遷等[16]研究表明凝結(jié)芽孢桿菌能顯著增加雞的產(chǎn)蛋率,降低死亡率;La Rosa等[17]則證明凝結(jié)芽孢桿菌可用于維持腸道菌群平衡,治療腹瀉,調(diào)節(jié)血脂血糖。

前期篩選分離得到的一株芽孢桿菌13002,經(jīng)鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌;經(jīng)急性毒理實(shí)驗證實(shí)安全無毒[18]。在此基礎(chǔ)上,本研究對作為潛在益生菌的凝結(jié)芽孢桿菌13002進(jìn)行了耐高溫、耐膽鹽、耐酸、抗菌活性、耐藥性五方面益生特性的研究,證明其具備實(shí)際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

凝結(jié)芽孢桿菌13002(Bacilluscoagulans13002) 由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全系從豆瓣醬中篩選并保藏;金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 均由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全系保藏;LB培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;瓊脂粉 健陽生物科技有限公司;牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司;胃蛋白酶、青霉素G鈉 百瑞金生物科技有限公司;鹽酸 廣州化學(xué)試劑廠;鏈霉素、鹽酸四環(huán)素 廣州碩恒生物科技有限公司;實(shí)驗所用試劑 均為分析純;生理鹽水、膽鹽溶液、人工胃液、抗生素溶液(青霉素溶液、鏈霉素溶液、四環(huán)素溶液) 按文獻(xiàn)方法配制[19]。

JJ200Y型電子天平 美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司;SPX250BZ型生化培養(yǎng)箱、HZQX100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SWCJ1F型超凈工作臺 臺蘇凈集團(tuán)安泰公司;JW3021HR型高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司;XW80A型旋渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將已活化好的凝結(jié)芽孢桿菌13002,按照6%(v/v)接種濃度,接入裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于45 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,得培養(yǎng)液。

1.2.2 高溫耐受性測定 分別取1 mL培養(yǎng)液移入裝有經(jīng)45 ℃加熱處理的9 mL生理鹽水試管中,在不同設(shè)置溫度下(45、60、70、80 ℃)水浴加熱10 min,冷卻后用稀釋涂布平板法測定活菌總數(shù)(CFU/mL),并以未進(jìn)行水浴加熱(45 ℃)條件下的測定值作為空白對照,計算菌種存活率。

存活率(%)=實(shí)驗組活菌總數(shù)/對照組活菌總數(shù)×100

1.2.3 膽鹽耐受性測定 按照1.2.1中方法制備培養(yǎng)液。根據(jù)動物腸道環(huán)境和食糜消化規(guī)律[21],選取膽鹽濃度0.3%(w/v)的濃度作為耐受點(diǎn);分別取10 mL培養(yǎng)液移入裝著90 mL牛膽鹽濃度為0.3% LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于45 ℃、180 r/min培養(yǎng)0、4、8、12、24 h,用稀釋涂布平板法測定活菌總數(shù)(CFU/mL),并以0 h測定值作為空白對照,計算菌種存活率。

1.2.4 酸耐受性測定 按照1.2.1中方法制備培養(yǎng)液。根據(jù)胃液pH特點(diǎn)及食糜在胃部消化規(guī)律[20],選取pH2.0作為耐受點(diǎn);分別取10 mL培養(yǎng)液移入裝著90 mL pH2.0人工胃液的錐形瓶中,于45 ℃、180 r/min培養(yǎng)0、1、2、3、4 h,采用稀釋涂布平板法測定不同耐受時間下樣液所對應(yīng)活菌總數(shù)(CFU/mL),并以0 h測定值作為空白對照,計算菌種存活率。

1.2.5 對有害菌抑制活性測定 按照1.2.1中方法制備培養(yǎng)液。取一定量培養(yǎng)液,于6000 r/min離心15 min,取上清液。選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌兩種菌作為實(shí)驗菌,采用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h,制成菌懸液。采用牛津杯法[21]測定凝結(jié)芽孢桿菌13002抑菌活性,吸取200 μL不同菌懸液到LB固體培養(yǎng)基上,用無菌玻耙涂布均勻;將培養(yǎng)皿均分為三個扇形區(qū)域,在每個區(qū)域中心置放一個牛津杯,待放置穩(wěn)定后分別滴加上述所得上清液200 μL;用保鮮膜包好培養(yǎng)皿,在4 ℃ 冰箱中放置12 h,待菌液充分?jǐn)U散;再于37 ℃條件培養(yǎng)48 h,觀察抑菌效果并測量抑菌圈直徑。

1.2.6 抗生素耐藥性測定 按照1.2.1中所示的方法和條件培養(yǎng)24 h,得培養(yǎng)液。選取青霉素、鏈霉素、四環(huán)素作為實(shí)驗指示抗生素,并分別配制成50、50、10 mg/mL。采用試管二倍稀釋法[22]測定凝結(jié)芽孢桿菌13002對抗生素的耐藥性,取10支5 mL試管,以0號管作為對照,不添加抗生素,每只試管均添加1 mL培養(yǎng)基,1號管添加進(jìn)1 mL抗生素溶液,充分混勻后吸取1 mL樣液加入第2只試管中,以此類推,以二倍稀釋到最后一支試管,最后一支試管棄去1 mL樣液,每一支試管充分吹打均勻;再往每支試管中分別添加100 μL菌培養(yǎng)液,于45 ℃、180 r/min條件培養(yǎng)24 h;溶液澄清,不出現(xiàn)渾濁的最低抗生素濃度即為該抗生素對凝結(jié)芽孢桿菌13002的MIC值,并采用稀釋涂布平板法進(jìn)行驗證,活菌總數(shù)減少至不再出現(xiàn)的最低抗生素濃度即為MIC值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗過程每組實(shí)驗做3組平行。采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)計算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫耐受性

實(shí)際研究和生產(chǎn)當(dāng)中,高溫對益生菌及其制品的活性具有一定不良影響。因此,選取不同的高溫條件,研究了細(xì)胞高溫耐受性特性,結(jié)果如圖1所示。

圖1 耐受溫度對凝結(jié)芽孢桿菌13002存活率的影響Fig.1 Effect of tolerant temperatures on the growth of Bacillus coagulans 13002

由圖1可知,45 ℃凝結(jié)芽孢桿菌13002的活菌總數(shù)為1.120×108CFU/mL(對照),隨溫度上升,存活率呈現(xiàn)下降趨勢。60 ℃條件下存活率可達(dá)到92.9%,至80 ℃條件下存活率仍可達(dá)到72.3%。實(shí)驗結(jié)果說明:凝結(jié)芽孢桿菌13002具備較好的高溫耐受性。而徐賢[19]研究表明,凝結(jié)芽孢桿菌C8在80 ℃條件下作用10 min,存活率為41.7%,遠(yuǎn)低于本研究中的凝結(jié)芽孢桿菌存活率;王艷萍等[23]研究表明,一株凝結(jié)芽孢桿菌TQ33在60 ℃和80 ℃條件下分別進(jìn)行10 min濕熱處理,存活率分別達(dá)到84.8%和78.9%;可見本研究中凝結(jié)芽孢桿菌13002在60 ℃條件下具有更好的耐熱性,但隨溫度上升,耐熱能力下降稍快,但同樣具有良好的抗熱性能。若將該菌株應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn),則可以抵御高溫處理的影響,在生產(chǎn)過程中保持較好的活性。

2.2 膽鹽耐受性

膽鹽是腸道中參與脂肪消化和吸收的主要成分,濃度主要在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動,能夠刺激腸道蠕動,抑制非腸道菌群的生長[24]。菌種是否具有耐膽鹽的性質(zhì)決定了其在動物腸道中的存活率,對宿主健康起促進(jìn)作用。

由圖2可知,以0.3%的膽鹽作用0 h測得的凝結(jié)芽孢桿菌13002活菌總數(shù)為對照(1.290×108CFU/mL),隨膽鹽作用時間的延長,活菌總數(shù)不斷減少,存活率也呈現(xiàn)下降趨勢,但下降速率不斷減緩。作用4 h時,活菌總數(shù)依然在108CFU/mL以上,存活率達(dá)到83.7%;作用12 h時,活菌數(shù)降低為69.8%。膽鹽作用24 h的活菌總數(shù)出現(xiàn)反彈,存活率不降反升,達(dá)到81.4%,這可能是因為在培養(yǎng)基營養(yǎng)充足條件下,凝結(jié)芽孢桿菌13002開始適應(yīng)并增殖。

圖2 膽鹽對凝結(jié)芽孢桿菌13002存活率的影響Fig.2 Effect of bile on the growth of Bacillus coagulans 13002

結(jié)果表明,凝結(jié)芽孢桿菌13002具有較好膽鹽耐受性,培養(yǎng)12 h存活率可達(dá)70%左右。食糜消化經(jīng)過動物胃、腸道之后,排出的時間基本上在8～12 h之間[24],這與膽鹽的作用時間相對應(yīng),所以實(shí)驗中耐受時間24 h時,膽鹽對菌株生長的抑制效果減弱而使活菌總數(shù)上升。因此可以推測,在膽鹽環(huán)境中,凝結(jié)芽孢桿菌只能在一定時間范圍內(nèi)起作用。郭小華等[25]研究表明,凝結(jié)芽抱桿菌在0.3%的膽鹽液中,生長在開始階段受到了抑制,過一段時間凝結(jié)芽抱桿菌能夠適應(yīng)并且在這種環(huán)境中增殖生長;本研究當(dāng)中凝結(jié)芽孢桿菌13002在膽鹽環(huán)境中的生長趨勢與前人研究相符。而王金果等[26]研究表明,凝結(jié)芽孢桿菌N001在0.9%膽鹽條件下作用24 h,存活率達(dá)78.3%,在0.3%膽鹽條件下作用24 h,存活率則達(dá)到84.3%,可知其膽鹽耐受性略高于本研究當(dāng)中的凝結(jié)芽孢桿菌13002。以上結(jié)果與本實(shí)驗?zāi)Y(jié)芽孢桿菌13002存活率情況具有一致性,可推測凝結(jié)芽孢桿菌13002在腸道當(dāng)中存活和增殖具有較大的可能性和可行性。

2.3 酸耐受性

胃分泌的胃酸讓食物在酸性條件下更易分解成小分子而被機(jī)體吸收,營造酸性環(huán)境能夠抑制細(xì)菌生長,同時增加胃蛋白酶活性,幫助消化吸收。正常情況下,胃酸的pH在2.0以下,胃排空時間在2～4 h[27]。菌種是否具有耐酸的性質(zhì),決定其是否能在胃中存活更久。根據(jù)食糜消化規(guī)律,模擬胃環(huán)境,配制pH2.0的人工胃酸,研究了不同作用時間對菌種增長的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 酸作用時間對凝結(jié)芽孢桿菌13002存活率的影響Fig.3 Effect of different time of acid tolertance on the growth of Bacillus coagulans 13002

由圖3可知,以0 h測得的菌種活菌總數(shù)為參照,即為0.950×108CFU/mL,隨耐酸時間的增加,菌種的活菌總數(shù)不斷減少,存活率也呈現(xiàn)下降趨勢。耐受時間2 h,活菌總數(shù)為0.500×108CFU/mL,存活率為52.6%,到4 h時,存活率依然達(dá)40.0%。

結(jié)果表明,凝結(jié)芽孢桿菌13002具備較好的酸耐受性。在胃排空時間范圍內(nèi),菌種存活率能達(dá)到40%及以上;隨著時間延長,胃酸抑菌效果可能呈現(xiàn)出減弱的趨勢。王金果等[27]研究表明,凝結(jié)芽孢桿菌N001在pH2.0條件下放置6 h,存活率可達(dá)48.2%,且隨著pH上升,存活率增加,可知N001具有較好的活性。本研究當(dāng)中凝結(jié)芽孢桿菌13002在相同處理條件下的存活率略低于N001,但也證明該結(jié)果與前人研究結(jié)果具有一致性。從以上結(jié)果可推測在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中,凝結(jié)芽孢桿菌在通過胃部的時候,能夠有足夠的數(shù)量,從而保持活性,發(fā)揮益生作用。

2.4 對有害菌的抗菌活性

凝結(jié)芽孢桿菌能產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物,李剛等[28]研究證明其代謝產(chǎn)物具有抑菌特性。菌種代謝產(chǎn)物是否具有抑菌性質(zhì),決定其與有害菌共同生存競爭時是否具有優(yōu)勢,從而對宿主健康起促進(jìn)作用。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌株,研究了凝結(jié)芽孢桿菌13002的抗菌活性。其中,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,兼性厭氧型;大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,兼性厭氧型。結(jié)果如表1所示。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌13002對有害菌的抗菌活性Table 1 The antibacterial activities of Bacillus coagulans 13002 to harmful bacteria

由表1可知,凝結(jié)芽孢桿菌13002代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為13.650 mm,大腸桿菌的為14.367 mm;對大腸桿菌的抑菌能力相對較強(qiáng),對金黃色葡萄球菌的相對較弱。

結(jié)果表明,凝結(jié)芽孢桿菌13002對細(xì)菌具備一定的抑菌能力,對不同種類的細(xì)菌抑菌效果存在差異,但抗菌活性均并不十分明顯。凝結(jié)芽孢桿菌13002發(fā)酵產(chǎn)L乳酸[18],推測通過代謝產(chǎn)生乳酸抑制有害菌的生長。

余岳等[20]對一株凝結(jié)芽孢桿菌芽孢抗逆性進(jìn)行研究,以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為指示菌種,得到金黃色葡萄球菌對應(yīng)測得的抑菌圈直徑為11 mm,大腸桿菌的為14 mm。該結(jié)果與本實(shí)驗結(jié)果相近,說明凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌的抑菌能力強(qiáng)于對金黃色葡萄球菌,同時也一定程度證明本實(shí)驗具有參考價值。

2.5 對抗生素的耐藥性

根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌性質(zhì)及抗生素分類,研究了凝結(jié)芽孢桿菌13002對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素三種抗生素的耐藥性,結(jié)果如表2～表4所示。

表2 青霉素對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Table 2 Effect of penicilin on the growth of Bacillus coagulans 13002

表3 鏈霉素對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Table 3 Effect of streptomycin on the growth of Bacillus coagulans 13002

由表2～表4可知,通過試管二倍稀釋法觀察及稀釋涂布平板法驗證后,隨抗生素濃度下降，溶液先澄清后不斷渾濁。證明凝結(jié)芽孢桿菌13002在抗生素濃度較高時，生長受到明顯抑制；之后不斷進(jìn)行稀釋，抑制作用減弱，到一定程度菌株開始生長。青霉素實(shí)驗濃度為0.781 mg/mL時,凝結(jié)芽孢桿菌13002不生長,再稀釋二倍則出現(xiàn)了生長現(xiàn)象,則可確定青霉素的MIC濃度。同理可得鏈霉素、四環(huán)素MIC濃度分別為0.391和0.039 mg/mL。MIC濃度從高到低排序依次是:青霉素、鏈霉素、四環(huán)素。

結(jié)果表明,凝結(jié)芽孢桿菌13002對不同種類抗生素的敏感程度不同,耐藥效果從高到低排序依次為:青霉素、鏈霉素、四環(huán)素。郭慧玲等研究了乳酸桿菌屬對抗生素的耐藥性[29],在此對凝結(jié)芽孢桿菌和部分乳酸桿菌對抗生素的耐藥性做初步比較。植物乳桿菌對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的MIC范圍分別處于1.25～80、80～1280、40 μg/mL;干酪乳桿菌對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的MIC濃度范圍分別在1.25～20、10～1280、0.625～80 μg/mL;則凝結(jié)芽孢桿菌13002對青霉素的耐藥性要好于植物乳桿菌和干酪乳桿菌,對四環(huán)素的耐藥性與乳酸桿菌相似,乳酸桿菌對鏈霉素的耐藥性,部分好于凝結(jié)芽孢桿菌13002,部分較差。

3 結(jié)論

本實(shí)驗通過對凝結(jié)芽孢桿菌13002的研究,可得該菌株具有較好的高溫耐受性,在80 ℃條件下作用10 min,存活率可達(dá)到72.3%;菌種具有較好的膽鹽耐受性,培養(yǎng)12 h存活率可達(dá)69.8%;菌種具有較好的酸耐受性,pH2.0的胃酸條件下作用4 h,菌種存活率能達(dá)到40.0%;菌種對細(xì)菌具備一定的抑菌能力,對不同種類的細(xì)菌抑菌效果存在差異;菌種對不同種類抗生素的耐藥性不同,作用從高到低排序依次為青霉素、鏈霉素、四環(huán)素,對應(yīng)的MIC值為0.781、0.391、0.039 mg/mL。凝結(jié)芽孢桿菌13002具有良好的益生特性,具有很好的開發(fā)和研究前景。

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