響應曲面法優化酶解豆粕蛋白制備降糖肽的工藝

余 敏,黃晶晶,付瑞燕,謝寧寧,*,殷俊峰,鄢 嫣,張福生

(1.安徽省農業科學院農產品加工研究所,安徽合肥 230031;2.安徽農業大學茶與食品學院,安徽合肥 230036)

降糖肽通常指能夠用于治療II型糖尿病的一類活性肽[1],目前主要來源于苦瓜[2]、山杏[3]、人參[4]、海產[5]和乳[67]等。而葡萄糖苷酶抑制劑作為降糖肽的一種[8],能夠競爭性抑制小腸葡萄糖苷酶活性,延緩或抑制葡萄糖吸收,有效降低餐后血糖[9]。豆粕,是大豆經過冷榨制油后得到的副產品,蛋白質含量約為45%～52%。豆粕蛋白經過酶解處理后,才能夠生成具有多種生物功能的活性肽,主要包括抗氧化肽[10]、血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽[1112]、金屬螯合肽[13]等。研究團隊前期研究發現,豆粕蛋白酶解產物具有優異的α葡萄糖苷酶抑制活性,可作為葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽的良好來源。目前降糖肽的生產工藝包括將苦瓜汁稀釋后經過超濾分離降糖肽[2]或采用堿溶酸沉法提取山杏蛋白[3]等,生產成本較高,環境污染較重。同時,豆粕蛋白酶解產物濃度高、溶解性好,且未見豆粕蛋白降糖肽的相關研究報道。因此,利用蛋白酶解豆粕生產降糖肽前景較好[4]。

本研究以大豆豆粕為原料,采用蛋白提取和酶解技術,運用單因素實驗和響應曲面實驗設計優化堿性蛋白酶(Alcalase)水解大豆豆粕工藝,并進行工藝驗證,以期為豆粕蛋白的開發利用提供新的解決策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆豆粕 合肥立新食品科技有限公司(粗蛋白質≥46.0%);鹽酸、硫酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、碳酸鈉 分析純,北京化工廠;石油醚 分析純,天津市津東天正精細化學試劑廠;α葡萄糖苷酶 液態,酶活≥50 units/mg蛋白質,上海源葉生物科技有限公司;堿性蛋白酶 液態,酶活0.6 AU/g,丹麥諾和諾德公司;4硝基苯酚βD吡喃葡萄糖苷 PNPG,液態,上海寶曼生物科技有限公司。

JA1103N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;PHS3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;TGL16M型離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;FD1CE型冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司;HR801型酶標分析儀 深圳市華科瑞科技有限公司;ZD85型氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市精達儀器制造有限公司;HH型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 大豆豆粕→脫脂→堿提取、酸沉淀→冷凍干燥→大豆蛋白粉→溶解→調節pH成堿性→加酶→酶解→滅酶→調節pH→離心→取上清液→測定α葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.2 蛋白提取 將大豆豆粕浸泡于石油醚中,多次更換石油醚,直至石油醚層用旋轉蒸發儀蒸干后無剩余物質,說明脫脂徹底。抽濾,置于通風櫥中室溫干燥12 h,密封保存。

采用堿溶酸沉法[3]提取大豆豆粕分離蛋白。將脫脂大豆豆粕用去離子水溶解,料液比1∶10(w∶v)。待完全溶解后用0.2 mol/L NaOH溶液調節pH至9.0,靜置60 min,抽濾,收集液體于室溫下以4000 r/min離心15 min,收集上清液。然后用0.2 mol/L HCl溶液將上清液的pH調至4.0,靜置30 min,再次于室溫下以5000 r/min離心15 min,取其下層沉淀物質,在干燥器中密封保存。

蛋白提取率(%)=提取的蛋白干重/豆粕中總蛋白干重×100

其中,干重是在恒溫干燥箱中將材料烘干(105 ℃)至恒重,用分析天平稱量獲得。

1.2.3 酶解 稱取適量大豆豆粕蛋白粉,加入適量去離子水溶解配制成具有一定濃度的蛋白溶液。將溫度調節至酶解反應溫度,用NaOH溶液與HCl溶液將pH調節至反應所需值,加入一定比例的堿性蛋白酶,放入氣浴恒溫振蕩器中進行恒溫酶解,保持反應體系pH恒定,達到預定反應時間后,將酶解液放入沸水浴15 min，使酶鈍化。酶解液在室溫中冷卻后,用NaOH溶液與HCl溶液調節pH至中性,于室溫下以4000 r/min離心10 min,所需的豆粕蛋白降血糖粗肽存在于上清液中,將其冷凍保存備用。采用TNBS法測定蛋白水解度(DH)[14]。

1.2.4 活性測定 在2 mL的離心管中依次加入5 μL 30 U/mL的α葡萄糖苷酶溶液、10 μL的樣品溶液、620 μL 0.1 mol/L pH為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻后在37.5 ℃條件下反應20 min。然后加入10 μL 10 mmol/L的PNPG溶液,混勻后在37.5 ℃條件下反應30 min。最后加入650 μL 0.2 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應。用分光光度計測定每個樣品在410 nm波長下的最大吸光度[15]。α葡萄糖苷酶抑制率計算公式為:

α葡萄糖苷酶抑制率(%)=[A空白(A樣品-A樣品對照)]/A空白×100

其中,A空白、A樣品、A樣品對照分別為空白組、樣品組和樣品對照組對應的吸光度值。

1.2.5 單因素實驗 選擇初始pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、酶解溫度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)、酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)、加酶量(1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%)和料液比(1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100、8∶100、9∶100)5個因素作單因素實驗,考察各單因素對酶解產物α葡萄糖苷酶抑制活性的影響。將其中一個作為單因素時,其他四個因素的固定實驗水平分別是初始pH9.0、酶解溫度45.0 ℃、酶解時間6 h、加酶量2%(w∶w)和料液比1∶20(w∶v)。

1.2.6 響應曲面分析方法 根據BoxBehnken中心組合實驗設計的原理,綜合單因素實驗結果,選擇單因素實驗中的顯著因素(初始pH、酶解溫度和酶解時間)進行優化[16],見表1。

表1 響應曲面分析因素及水平表Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.3 數據統計與分析

每次實驗重復3次,取平均值。實驗數據以平均值±標準偏差的形式表示,采用DesignExpert 8.0.5軟件設計響應曲面實驗方案并進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白提取率

采用堿溶酸沉法提取豆粕分離蛋白,提取率為60.56%,與已有研究結果相似。李桂菊[16]發現,蛋白提取率達到最高值66.51%。

2.2 酶解單因素實驗

2.2.1 初始pH對酶解產物抑制活性的影響 圖1顯示,初始pH在8.0～10.0時酶解產物對α葡萄糖苷酶抑制活性較高,初始pH為9.0時達到最高點,為13.5%(p<0.05)。當初始pH小于或大于9.0時,酸堿條件會影響酶的活性和底物的構象[17]。因此反應體系的初始pH應控制在9.0左右。

圖1 初始pH對酶解產物活性的影響Fig.1 Effect of initial pH value on enzymatic hydrolysates activity注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖5同。

2.2.2 酶解時間對酶解產物抑制活性的影響 圖2顯示,酶解產物對α葡萄糖苷酶的抑制活性在酶解4 h左右時達到了最高點與5 h時α葡萄糖苷酶抑制率無顯著差異(p>0.05),但顯著高于其他酶解時間(p<0.05),而在4 h后呈緩慢下降趨勢,這可能是由于酶解底物中包含了可溶性蛋白和不溶性蛋白,可溶性蛋白的敏感性肽鍵會在最初階段快速斷裂,而不敏感肽鍵斷裂緩慢;而不溶性蛋白的酶解過程中,酶吸附在不溶性蛋白的表面,首先水解結合較稀疏的聚合肽,然后再緩慢水解中心的肽鍵[18]。另外,酶解6 h后具有活性的肽鏈被過度酶解,結構被破壞,導致酶解產物的抑制活性大大降低。綜合考慮，反應體系的的酶解時間應控制在4 h左右。

圖2 酶解時間對酶解產物活性的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysates activity

2.2.3 溫度對酶解產物抑制活性的影響 圖3顯示,溫度從40 ℃上升至50 ℃時,酶解產物對α葡萄糖苷酶的抑制活性緩慢增加,在50 ℃時達到最高(p<0.05)。隨著溫度繼續升高,蛋白酶的活性受到抑制,酶解的速度降低,酶解產物對α葡萄糖苷酶的抑制活性也會降低,與薛照輝[19]等的研究結果相似,他發現堿性蛋白酶水解鷹嘴豆分離蛋白在50 ℃時水解度達到最大。因此反應體系的的酶解溫度應控制在50 ℃左右。

圖3 酶解溫度對酶解產物活性的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysates activity

2.2.4 加酶量對酶解產物抑制活性的影響 圖4顯示,加酶量小于1.5%時,其變化對酶解產物的α葡萄糖苷酶抑制活性影響很小。當加酶量高于1.5%時,由于底物相對較少,酶含量相對較高,所以酶解產物的抑制活性顯著增加(p<0.05)。結果表明,只要加酶量大于2.0%后,加酶量將不再影響酶解產物對α葡萄糖苷酶的抑制活性。另外,由于酶本身也是蛋白質,也會發生酶解,加酶量過高則會干擾酶解產物的組成[2021]。因此,從經濟和效率考慮,加酶量應保持在2.0%左右。

圖4 加酶量對酶解產物活性的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on enzymatic hydrolysates activity

2.2.5 初始料液比對酶解產物抑制活性的影響 圖5顯示,當初始料液比為5∶100時,酶解產物的抑制活性達到最高點，顯著高于料液比1∶100和3∶100時的抑制率(p<0.05),而且此后無顯著變化(p>0.05)。這可能是因為植物蛋白中含有植物蛋白酶抑制劑,能與蛋白酶作用與底物共享蛋白酶的結合基團,表現出競爭性抑制作用[17]。因此反應體系的初始料液比應控制在5∶100左右。

圖5 初始料液比對酶解產物活性的影響Fig.5 Effect of initial solidliquid ratio on enzymatic hydrolysates activity

可見,初始pH、酶解時間、酶解溫度這三個因素影響顯著(p<0.05),加酶量以及料液比影響不顯著(p>0.05)。因此,在響應曲面實驗中只對初始pH、酶解時間和酶解溫度這三個因素進行優化,選擇料液比為5∶100、加酶量為2%作為固定實驗條件。

2.3 響應曲面法優化酶解工藝

2.3.1 響應曲面分析結果 根據DesignExpert 8.0.5軟件設計的三因素三水平的響應曲面實驗,進行響應曲面實驗,結果見表2。

表2 響應曲面實驗結果Table 2 Results of response surface methodology

采用DesignExpert 8.0.5軟件程序對以上的實驗數據進行二次多元回歸擬合,分析結果得出堿性蛋白酶(Alcalase)酶解大豆豆粕蛋白制備降糖肽的回歸方程為:

Y=335.53975+51.44350A+3.39438B+7.67712C0.039750AB+0.30875AC0.059000BC-2.63200A20.028445B20.76112C2

為了檢驗上述方程的有效性,對回歸模型進行方差分析,結果見表3。

表3 響應曲面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

表3表明模型p<0.0001,說明堿性蛋白酶酶解大豆豆粕蛋白制備降糖肽的α葡萄糖苷酶抑制率的回歸方程模型極顯著,同時失擬差p為0.1146>0.05不明顯,進一步說明了該模型的合理性。因此可以用此模型對整個實驗結果進行分析和預測。模型的分析參考類似研究[2223],均是從模型p值、失擬差等角度分析模型的統計學意義,判斷回歸方程預測的準確性。

三個因素對酶解產物抑制活性的影響比較復雜。在上述回歸方程的所有一次項中,對于酶解產物抑制活性的影響順序為A>C>B,其中A、C兩項影響極顯著(p<0.0001),所以初始pH和酶解時間對酶解產物的抑制活性影響較大;在所有的平方項中,A2、B2、C2三項的影響極顯著(p<0.0001);而交互項的影響就相對較小。結合表3中的F值大小,各因素對堿性蛋白酶酶解大豆豆粕蛋白制備降糖肽的α葡萄糖苷酶抑制率的作用順序依次為:初始pH>酶解時間>酶解溫度。

2.3.2 響應曲面分析圖示 采用DesignExpert 8.0.5軟件,帶入實驗數據,分別將模型中的初始pH(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)其中一個因素固定在0水平不變,得到其余兩個因素之間相互作用對于酶解產物抑制活性的影響。通過軟件的Model Graphs分別合成三因素間交互作用的三維圖和等高線圖,結果見圖6～圖11。

圖6 初始pH與酶解溫度交互作用的三維圖Fig.6 Response surface plots of initial pH value and hydrolysis temperature on the hydrolysates activity

圖7 初始pH與酶解溫度交互作用的等高線圖Fig.7 Contour map of initial pH value and hydrolysis temperature on the hydrolysates activity

圖8 酶解溫度與酶解時間相互作用的三維圖Fig.8 Response surface plots of hydrolysis temperature and time on the hydrolysates activity

圖9 酶解溫度與酶解時間交互作用的等高線圖Fig.9 Contour map of hydrolysis temperature and time on the hydrolysates activity

圖10 初始pH與酶解時間交互作用的三維圖Fig.10 Response surface plots of initial pH value and hydrolysis time on the hydrolysates activity

圖11 初始pH與酶解時間交互作用的等高線圖Fig.11 Contour map of initial pH value and hydrolysis time on the hydrolysates activity

觀察圖6～圖11,可見設計的三個因素中對酶解液降血糖活性影響最大的是初始pH,其次是酶解時間,而酶解溫度對活性影響最小。

2.3.3 最佳酶解工藝條件的確定 使用Design-Expert 8.0.5軟件對上述回歸方程進行分析,確定最佳酶解工藝條件為:初始pH9.55、酶解溫度48.54 ℃,酶解時間5.29 h。在此工藝條件下,酶解產物的抑制活性預測值為14.80%。

考慮到實驗條件的可行性等問題,修正酶解工藝條件為:初始pH9.5,酶解溫度49 ℃,酶解時間5.5,在此條件下,3次平行實驗進行驗證,得到豆粕降血糖粗肽對α葡萄糖苷酶的抑制活性為14.82%±0.23%,高于預測值0.02%。同時,由于水解度與酶解產物活性有一定關系[24],測量發現該酶解工藝條件下蛋白水解度為23.26%。證明了響應曲面分析法對于酶解工藝的優化結果準確可靠。

3 結論

在單因素實驗基礎上,采用響應曲面優化了堿性蛋白酶水解大豆豆粕蛋白制備葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽的工藝,獲得的最優工藝參數為:初始pH9.5,酶解溫度49 ℃,酶解時間5.5 h,料液比5∶100,加酶量2%。采用該工藝條件進行制備時,蛋白水解度為23.26%,降血糖肽對α葡萄糖苷酶的抑制率為14.82%±0.23%%。研究表明,在此工藝條件下制備的豆粕蛋白葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽具有很好的降血糖活性,同時豆粕蛋白作為天然成分，沒有人工合成藥物的副作用。此外,研究還可以進一步深入,包括對酶解產物進行分離純化、結構鑒定,獲得純品;另外也可以開發功能性飲料等產品。

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