基于柑橘的多酵母協(xié)同發(fā)酵料酒的制備

李 欣,付彩霞,李軍鵬,余紅波,鄒 濤,王 志,代 俊,陳 雄,陳世貴,*

(1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心,工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北工業(yè)大學(xué),湖北武漢 430068;2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司,湖北宜都 443302)

料酒是專(zhuān)門(mén)用于烹飪調(diào)味的酒,是調(diào)味品行業(yè)重要品類(lèi)之一,在我國(guó)已有上千年的使用歷史[12]。日本、美國(guó)、歐洲的某些國(guó)家也有使用料酒的習(xí)慣[3]。我國(guó)的傳統(tǒng)料酒是用釀造黃酒浸泡香辛料制得。菌種方面,在充分利用自然微生物群系的基礎(chǔ)上,為提高淀粉糖化效率和葡萄糖的乙醇轉(zhuǎn)化效率,采用定向篩選技術(shù)挖掘高糖化酶活力的米曲霉和耐高溫的高產(chǎn)乙醇釀酒酵母[78]。

近十幾年來(lái),隨著人民生活水平的提高和對(duì)調(diào)味品新風(fēng)味的追求,水果汁或蔬菜汁等被作為新風(fēng)味的來(lái)源應(yīng)用于調(diào)味品的產(chǎn)品。這些新輔料或作為發(fā)酵原料添加到黃酒或米酒的釀造過(guò)程中以制備料酒,或作為配制原料按照一定比例與黃酒或食用酒精混合來(lái)生產(chǎn)料酒[910]。柑橘富含豐富的生物活性[1113]和風(fēng)味物質(zhì)[14],已成功用于飲料果酒[1516]和傳統(tǒng)釀造食品醬油[17]的生產(chǎn)。柑橘的應(yīng)用為這些產(chǎn)品提供了新風(fēng)味和新口感。

多菌種發(fā)酵策略是食品釀造工業(yè)中常用的策略,其最大優(yōu)勢(shì)既能利用不同微生物代謝特征提供豐富的代謝產(chǎn)物,如各種氨基酸和有機(jī)酸,又能賦予釀造食品獨(dú)特的風(fēng)味。在傳統(tǒng)料酒生產(chǎn)中,酵母處于至關(guān)重要的地位。

本文以柑橘作為發(fā)酵主要原料,采用多酵母(乙醇酵母和風(fēng)味酵母)協(xié)調(diào)組合發(fā)酵技術(shù)來(lái)制備柑橘型料酒。在最適發(fā)酵條件下,主要指標(biāo)達(dá)到料酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),且柑橘風(fēng)味顯著,為開(kāi)發(fā)柑橘型料酒產(chǎn)品奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母(Saccharomycecerevisiae)TLH 湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司;魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)CCTCC M 2013310、球擬酵母(Torulopsis) 本實(shí)驗(yàn)室從醬油中分離純化獲得;柑橘 湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司;乳酸標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg/100 mL) 山東科學(xué)院生物研究所提供;3,5二硝基水楊酸(3,5dinitrosalicylic acid,DNS)(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖(食品級(jí)) 山東祥瑞藥業(yè)有限公司;體積分?jǐn)?shù)95%酒精(醫(yī)用級(jí)) 武漢興和達(dá)商貿(mào)有限公司;酵母粉、蛋白胨(生化試劑) 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;YEPD培養(yǎng)基 酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL,pH6.0。

SBA生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所;AMR612型均質(zhì)機(jī) 中國(guó)安蜜爾電器實(shí)業(yè)有限公司;BL75A型高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司公司;HNY211B型恒溫?fù)u床 天津歐諾儀器儀表有限公司;ZSDA1160A型恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;CT15RE型離心機(jī) 日本日立公司;V1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;5804R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 柑橘料酒制備工藝流程如圖1所示。

圖1 柑橘料酒工藝流程Fig.1 The technological process of citrus cookingwine

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 柑橘處理方法 用75%乙醇對(duì)柑橘表面進(jìn)行消毒,皮肉分離,再用經(jīng)75%乙醇消毒處理的均質(zhì)機(jī)分別均質(zhì)破碎,8000 r/min離心10 min,收集柑橘肉和柑橘皮離心液于20 ℃保存,保存期不超過(guò)4周。

1.2.2.2 酵母菌活化及酵母泥制備方法 用無(wú)菌接種環(huán)從酵母活化斜面上取一環(huán),接入YEPD培養(yǎng)基中,在30 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取1 mL酵母活化液于8000 r/min離心10 min,收集離心沉淀作為酵母泥用于料酒發(fā)酵。1 mL酵母活化液所收集到的酵母泥定義為1份活化酵母泥。

1.2.2.3 活化酵母泥的加入 從發(fā)酵基液中吸取1 mL加入1份活化酵母泥中,用移液槍吹吸打散酵母泥,再全部轉(zhuǎn)移至發(fā)酵基液中。

1.2.2.4 料酒發(fā)酵方法 含有柑橘組分、酵母泥和輔料的混合液,振蕩混勻后于30 ℃條件下靜置培養(yǎng)144 h。

1.2.3 柑橘組分對(duì)單一酵母發(fā)酵的影響 在初始葡萄糖濃度為60 mg/mL條件下,于不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘果肉汁或/和柑橘皮汁中添加一定濃度的活化酵母泥,振蕩混勻后靜置發(fā)酵,并每隔24 h取樣進(jìn)行檢測(cè),以分析魯氏酵母、球擬酵母和釀酒酵母在不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘果肉汁或/和柑橘皮汁條件下的乙醇和乳酸積累規(guī)律。

1.2.4 協(xié)同酵母料酒發(fā)酵技術(shù)研究

1.2.4.1 初始葡萄糖濃度的確定 在同時(shí)接種混合酵母(釀酒酵母∶魯氏酵母∶球擬酵母,1份∶1份∶1份)條件下,全柑橘汁中添加不同濃度的葡萄糖(20、60、120、180和240 mg/mL),振蕩混勻后靜置發(fā)酵,并每隔24 h取樣用于檢測(cè)殘?zhí)恰⒁掖己腿樗釢舛取?/p>

1.2.4.2 初始酵母浸粉濃度的確定 在同時(shí)接種混合酵母(釀酒酵母∶魯氏酵母∶球擬酵母,1份∶1份∶1份)條件下,在含有60 mg/mL葡萄糖的全柑橘汁中添加不同濃度的酵母浸粉(1%、2%、3%、4%和5%),振蕩混勻后靜置發(fā)酵,并每隔24 h取樣用于檢測(cè)殘?zhí)恰⒁掖己腿樗釢舛取?/p>

1.2.4.3 三種酵母復(fù)配比例的確定 在含有120 mg/mL初始葡萄糖全柑橘汁中(不添加酵母浸粉),按不同復(fù)配濃度(1份∶1份∶1份、2份∶1份∶1份、1份∶2份∶1份、1份∶1份∶2份、2份∶2份∶2份)加入釀酒酵母、魯氏酵母合和球擬酵母,振蕩混勻后靜置發(fā)酵,并每隔24 h取樣用于檢測(cè)殘?zhí)恰⒁掖己腿樗釢舛取?/p>

1.2.4.4 三種酵母復(fù)配順序的確定 在含有120 mg/mL初始葡萄糖和1%酵母粉的全柑橘汁中,按2份∶2份∶2份的比例和表1所示的添加順序加入釀酒酵母、魯氏酵母合和球擬酵母,振蕩混勻后靜置發(fā)酵,并每隔24 h取樣用于檢測(cè)乙醇和乳酸濃度。

表1 三種酵母添加組合策略Table 1 The adding strategy of three yeasts

1.2.5 測(cè)定方法 適量發(fā)酵樣品在4 ℃、8000 r/min下離心10 min,收集上清液用于殘?zhí)恰⑷樗岷鸵掖嫉臏y(cè)定。

采用DNS(3,5二硝基水楊酸)比色法(540 nm)測(cè)定殘?zhí)菨舛萚18]。以響應(yīng)值為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)方程:y=1.4597x+0.01272,偏差R2為0.999。

采用SBA生物傳感儀檢測(cè)乙醇和乳酸濃度[1920]。其中乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的配制:將25 μL無(wú)水乙醇加入100 mL容量瓶中,并用去離子水定容,所配得乙醇質(zhì)量濃度為20 mg/100 mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。運(yùn)用Excel計(jì)算平均值,并運(yùn)用Origin 8.6軟件對(duì)發(fā)酵數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘組分對(duì)單一酵母發(fā)酵的影響

釀酒酵母具有顯著的乙醇合成能力[21],魯氏酵母和球擬酵母均是典型的風(fēng)味形成酵母[22]。柑橘組分對(duì)微生物的生長(zhǎng)可能存在不同的影響[2324],因此本研究分析這3種酵母在柑橘組分存在條件下的發(fā)酵能力差異,為建立組合酵母發(fā)酵生產(chǎn)料酒奠定基礎(chǔ)。同時(shí),調(diào)味料酒中的兩個(gè)主要指標(biāo)(乙醇和乳酸)被作為發(fā)酵評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[25]。

2.1.1 柑橘組分對(duì)魯氏酵母發(fā)酵影響 在初始葡萄糖濃度為60 mg/mL時(shí),不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)對(duì)魯氏酵母乙醇和乳酸積累的影響如圖2A和2B。結(jié)果表明,在發(fā)酵的0～72 h,乙醇在持續(xù)積累,72 h后乙醇濃度逐漸降低。值得注意的是,柑橘果肉汁的含量越高,發(fā)酵過(guò)程中所積累的乙醇濃度越高。這表明高濃度的柑橘果肉汁對(duì)提高乙醇濃度具有正向效果。與乙醇生成轉(zhuǎn)化不同的是,添加柑橘肉汁在0%～50%對(duì)乳酸積累的差異不大,但75%和100%柑橘肉汁濃度從48 h開(kāi)始大量積累乳酸,最大乳酸積累濃度分別達(dá)到0.82和1.74 mg/mL。

圖2 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)對(duì)魯氏酵母乙醇(A和C)或乳酸(B和D)積累的影響Fig.2 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Zygosaccharomyces rouxii

添加有60 mg/mL初始葡萄糖的不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%或20%)對(duì)魯氏酵母發(fā)酵的影響如圖2C和2D所示。無(wú)論添加何種濃度的柑橘皮汁,其乙醇濃度均低于對(duì)照(%)。然而,在有柑橘皮汁存在情況下,除5%柑橘皮汁濃度外,乙醇的濃度都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。同時(shí),最大乙醇積累濃度也隨著柑橘皮濃度的提高而提高。在20%柑橘皮濃度下,最大乙醇積累濃度達(dá)到2.04 mg/mL。這些結(jié)果表明柑橘皮具有刺激魯氏酵母合成乙醇的功能。柑橘皮對(duì)魯氏酵母積累乳酸的影響與柑橘肉的作用截然不同。添加柑橘皮后,除對(duì)照和5%柑橘皮汁濃度外,乳酸水平分別在48 h(10%)、48 h和120 h(15%)、72 h(20%)達(dá)到最大,隨后其濃度幾乎維持恒定,保持在0.12～0.16 mg/mL之間。

2.1.2 柑橘組分對(duì)球擬酵母發(fā)酵影響 圖3A和3B顯示了在60 mg/mL的初時(shí)葡萄糖中添加不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)對(duì)球擬酵母積累乙醇和乳酸的影響。結(jié)果表明,柑橘果肉汁的添加能明顯促進(jìn)球擬酵母合成乙醇。乙醇經(jīng)過(guò)第一階段的緩慢積累(0～72 h,積累量為(4.00±0.50)mg/mL),和第二階段的快速積累(72～120 h),至發(fā)酵終點(diǎn)其濃度在(25.00±3.00) mg/mL左右。這表明柑橘果肉汁具有刺激球擬酵母合成乙醇的作用,然而,這種刺激效應(yīng)并不與柑橘果肉汁濃度有正向?qū)?yīng)關(guān)系。乳酸濃度在發(fā)酵第72 h達(dá)到最大,并在發(fā)酵后期被利用。在大部分柑橘果肉汁濃度下,最大乳酸積累量在0.30 mg/mL,除50%濃度外(0.53 mg/mL)。可見(jiàn),柑橘果肉汁的添加有助于球擬酵母大量合成乙醇,且不會(huì)引起乳酸水平的提高。

圖3 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)對(duì)球擬酵母乙醇(A和C)和乳酸(B和D)積累的影響Fig.3 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Torulopsis

圖3C和3D展現(xiàn)了含有60 mg/mL初始葡萄糖的不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%、或20%)對(duì)球擬酵母積累乙醇和乳酸的影響。與對(duì)魯氏酵母的影響相似,無(wú)論添加何種濃度的柑橘皮汁,球擬酵母所積累的乙醇濃度均沒(méi)有對(duì)照高。然而,在添加有柑橘皮汁的情況下,柑橘皮汁有助于在發(fā)酵早期提高球擬酵母的乙醇產(chǎn)量,且產(chǎn)量提高程度與柑橘皮汁的添加濃度有正相關(guān)性。但在發(fā)酵48 h后,除15%柑橘皮濃度外,乙醇的濃度不再增加,甚至?xí)兴陆怠Ｌ砑痈涕倨ぶ?乳酸濃度表現(xiàn)為倒V字形變化過(guò)程,在72 h乳酸濃度達(dá)到最大。添加10%、15%和20%柑橘皮汁的發(fā)酵液中所得到的最大乳酸積累濃度相同,均在72 h達(dá)到0.30 mg/mL。這表明添加高濃度的柑橘皮汁不會(huì)促進(jìn)球擬酵母大量積累乳酸。

2.1.3 柑橘組分釀酒酵母發(fā)酵料酒影響 含有60 mg/mL的初始葡萄糖的不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)對(duì)釀酒酵母積累乙醇和乳酸的影響如圖4A和4B。無(wú)論是何種柑橘果肉汁濃度,在整個(gè)發(fā)酵周期,乙醇的濃度經(jīng)歷了緩慢增長(zhǎng)(0～72 h)、快速積累(72～96 h)、快速降低(96～120 h)和維持穩(wěn)定(120～144 h)四個(gè)變化階段,而且乙醇的最大積累濃度與柑橘果肉汁體積分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)表現(xiàn)為正相關(guān)性。最大柑橘果肉汁體積分?jǐn)?shù)下,其最大乙醇積累濃度為138.00 mg/mL(96 h)。無(wú)論添加多少柑橘果肉汁,乳酸在發(fā)酵早期都會(huì)持續(xù)積累,但在發(fā)酵的72～96 h期間,乳酸濃度都維持在0.10 mg/mL的水平上,隨后其濃度逐漸降低。

圖4 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)對(duì)釀酒酵母乙醇(A和C)和乳酸(B和D)積累的影響Fig.4 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Saccharomyce cerevisiae

含有60 mg/mL的初始葡萄糖的不同體積分?jǐn)?shù)的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%或20%)對(duì)釀酒酵母積累乙醇和乳酸的影響如圖4C和4D。乙醇的大量積累發(fā)生在72～96 h,隨后乙醇濃度快速下降。對(duì)乙醇而言,柑橘皮汁最佳添加濃度為10%,其最大乙醇積累濃度接近180 mg/mL。值得注意的是,在72～96 h發(fā)酵階段積累的乙醇濃度與96～120 h階段所減少的濃度非常相近,前者平均值為123.40 mg/mL,后者平均值為119.60 mg/mL,這表明發(fā)酵的有效積累乙醇濃度并不高。雖然柑橘皮汁的對(duì)釀酒酵母乙醇合成的刺激作用明顯,但發(fā)酵液中乙醇水平不穩(wěn)定,使得發(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度達(dá)不到目標(biāo)。在不添加柑橘皮汁時(shí),最大乳酸積累量首次出現(xiàn)在發(fā)酵第72 h。添加柑橘皮汁后,除20%條件外,其余3種條件下的乳酸濃度都在48 h達(dá)到最大,且在隨后的發(fā)酵期間,乳酸濃度均在(0.10±0.02) mg/mL波動(dòng),與對(duì)照處于相似的水平。這樣的結(jié)果表明柑橘皮汁對(duì)釀酒酵母發(fā)酵期間的乳酸沒(méi)有影響。

為充分利用釀酒酵母和風(fēng)味酵母(魯氏酵母和球擬酵母)的特性,為進(jìn)一步提高乙醇的濃度,混合酵母發(fā)酵柑橘料酒。上述研究結(jié)果表明柑橘果肉汁比柑橘皮汁更有利于料酒發(fā)酵,能有效提升3種酵母的乙醇合成水平。因此后續(xù)研究采用全柑橘汁(100%)作為發(fā)酵基液,并進(jìn)一步優(yōu)化了料酒發(fā)酵的工藝條件,包括葡萄糖和酵母粉的初始濃度、三種酵母的復(fù)配比例和濃度及添加順序等。

2.2 協(xié)同酵母料酒發(fā)酵技術(shù)研究

2.2.1 初始葡萄糖濃度優(yōu)化 釀酒酵母、魯氏酵母和球擬酵母對(duì)葡萄糖均有良好的利用能力。為避免三種酵母共酵條件下出現(xiàn)碳源不足從而導(dǎo)致生長(zhǎng)代謝活性的減弱，本研究首先優(yōu)化了初始葡萄糖濃度。圖5A顯示，初始葡萄糖濃度越高，殘留的葡萄糖濃度越高，這表明三種酵母的共存并沒(méi)有完全利用葡萄糖。這可能是三種酵母的生長(zhǎng)受到某種相同因素的限制。圖5A顯示,初始葡萄糖濃度越高,殘留的葡萄糖濃度越高,這表明同時(shí)添加三種酵母會(huì)降低葡萄糖的利用率。這可能是三種酵母的生長(zhǎng)受到某種相同因素的限制。

圖5 不同初始葡萄糖濃度對(duì)混合酵母發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)?A)、乙醇(B)和乳酸(C)的影響Fig.5 Effects of different initial glucose concentration on residual sugar(A),ethanol(B)and lactic acid(C) in mixed yeast fermentation process

圖5B結(jié)果顯示,當(dāng)葡萄糖濃度從20 mg/mL提高到60、120 mg/mL時(shí),乙醇的濃度并沒(méi)有同步增加,最大乙醇濃度不超過(guò)6.00 mg/mL。然而,當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)提高到180、240 mg/mL后,乙醇開(kāi)始大量積累,最大乙醇濃度分別達(dá)到9.20、13.20 mg/mL。這些結(jié)果表明,三種酵母在高濃度和低濃度葡萄糖下可能具有截然不同的代謝和相互作用。可見(jiàn),高濃度的初始葡萄糖濃度更有利于乙醇的大量積累。

圖5C顯示,在發(fā)酵前中期(0～96 h),除60、120 mg/mL初始葡萄糖濃度條件下的乳酸濃度幾乎檢測(cè)不到,其它條件下的乳酸濃度在0.06 mg/mL上下振蕩。然而,發(fā)酵96 h后,初始葡萄糖濃度20 mg/mL中的乳酸濃度開(kāi)始大幅上升至0.28 mg/mL,其它濃度條件下的乳酸濃度或下降或檢測(cè)不到。表明高濃度的初始葡萄糖會(huì)抑制乳酸的積累。這可為我們調(diào)控發(fā)酵過(guò)程中的乳酸積累量提供了一種手段。

義109-3井固井技術(shù)研究……………………………………………………………………………桂成梁，孫 鈺，趙清忠（1.8）

2.2.2 初始酵母浸粉濃度對(duì)料酒發(fā)酵影響 圖6A顯示,在不加入酵母浸粉時(shí),發(fā)酵終點(diǎn)的殘?zhí)菨舛葹?8.76 mg/mL。但添加1%酵母浸粉后,60 mg/mL葡萄糖在72 h被消耗完。當(dāng)進(jìn)一步提高酵母浸粉的濃度,葡萄糖消耗更迅速,24 h即被消耗完。可見(jiàn),酵母浸粉能促進(jìn)混合發(fā)酵過(guò)程中酵母對(duì)葡萄糖利用。同時(shí),添加酵母浸粉也顯著提高了乙醇的積累量,如圖6B。然而,無(wú)論添加多大濃度的酵母浸粉,發(fā)酵過(guò)程中的最大乙醇積累濃度均在20 mg/mL左右。值得注意的是,整體趨勢(shì)上，除對(duì)照外,酵母浸粉初始濃度越高,發(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度越低。乳酸積累濃度與酵母浸粉濃度表現(xiàn)出正相關(guān)性關(guān)系。5%的酵母浸粉濃度下的最大乳酸積累量達(dá)到2.09 mg/mL,而1%的酵母浸粉中只有0.78 mg/mL的最大乳酸積累量。

圖6 不同初始酵母浸粉濃度對(duì)混合酵母發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)?A)、乙醇(B)和乳酸(C)的影響Fig.6 Effects of different initial yeast powder concentration on residual sugar(A),ethanol(B)and lactic acid(C) in mixed yeast fermentation process

綜合初始葡萄糖和酵母粉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在同時(shí)添加釀酒酵母、魯氏酵母和球擬酵母進(jìn)行共發(fā)酵條件下,初始葡萄糖濃度不低于120 mg/mL,而初始酵母浸粉濃度不高于1%,既滿足乙醇的大量積累,也能避免乳酸的積累。

2.2.3 組合酵母的添加量對(duì)料酒發(fā)酵影響 由圖7A可知,在發(fā)酵期間,葡萄糖被持續(xù)消耗。三種酵母不同復(fù)配比例的差異主要體現(xiàn)在發(fā)酵終點(diǎn)的殘?zhí)巧稀Ｍ瑫r(shí)提高三種酵母的接種量所殘留的葡萄糖濃度最少,為36.54 mg/mL(接近初始葡萄糖濃度的1/4),而只提高魯氏酵母的接種量所殘留的糖濃度是最高的,為66.52 mg/mL(幾乎為初始葡萄糖濃度的一半)。

圖7 組合酵母添加量(釀酒酵母∶魯氏酵母∶球擬酵母)對(duì)葡萄糖消耗(A)、乙醇(B)和乳酸(C)積累的影響Fig.7 Effect of different adding concentration of three yeasts(S. cerevisiae,Z.rouxii and Torulopsis)on glucose consumption(A),ethanol(B)and lactate concentration(C)

無(wú)論提高何種酵母細(xì)胞的添加量都能明顯增加發(fā)酵液中乙醇的水平,而三種酵母的添加量都提高到2%所獲得乙醇濃度最大(19.20 mg/mL左右)。更重要的是,三種酵母接種量同時(shí)提高后,乙醇濃度在發(fā)酵后期沒(méi)有明顯的下降,這將非常有利于料酒的發(fā)酵。提高任意一種酵母的接種量都會(huì)導(dǎo)致乳酸濃度的增加,但是同時(shí)提高三種酵母的接種量卻不會(huì)造成乳酸積累最大化,反而只是提高球擬酵母的接種量能明顯促進(jìn)乳酸的積累,其最大積累濃度為0.18 mg/mL。

2.2.4 酵母添加順序?qū)α暇瓢l(fā)酵影響 上述研究結(jié)果顯示出,在同時(shí)添加釀酒酵母、球擬酵母和魯氏酵母情況下,三種酵母之間可能存在相互影響。為掌握三種酵母之間的互作規(guī)律,三種酵母的添加比例順序被優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)參數(shù)采用上述確定的發(fā)酵最優(yōu)初始條件:在1 L全柑橘汁中添加160 g葡萄糖和10 g酵母浸粉。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2。結(jié)果表明,單一降低釀酒酵母的接種量,都將導(dǎo)致發(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度降低。同時(shí),三種酵母的添加順序?qū)Πl(fā)酵終點(diǎn)的乳酸濃度沒(méi)有顯著影響,所有實(shí)驗(yàn)組中的乳酸濃度都分布在0.11～0.14 mg/mL。但是,三種酵母的添加比例和順序?qū)Πl(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度卻有顯著的影響。最佳添加比例和順序?yàn)?在發(fā)酵初期加入2%釀酒酵母細(xì)胞活化液,在發(fā)酵第24 h再加入2%球擬酵母細(xì)胞活化液,最后在發(fā)酵第48 h加入2%魯氏酵母細(xì)胞活化液。在此工藝下,發(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度達(dá)到145.00 mg/mL。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)添加酵母對(duì)釀造產(chǎn)乙醇和乳酸的影響Table 2 Effect of the addition of yeasts at different time point on ethanol and lactate content

3 結(jié)論

柑橘肉汁和柑橘皮汁對(duì)魯氏酵母、球擬酵母和釀酒酵母發(fā)酵料酒具有差異性影響。添加一定柑橘肉汁和柑橘皮汁均能刺激魯氏酵母提高乙醇和乳酸的積累量。柑橘肉汁有利于球擬酵母積累乙醇,而柑橘皮汁會(huì)抑制乙醇的積累。當(dāng)使用釀酒酵母時(shí),柑橘肉汁對(duì)乳酸的影響比較大,而柑橘皮汁除了能刺激酵母利用糖外,對(duì)乙醇和乳酸無(wú)大的影響。可見(jiàn),柑橘肉汁比柑橘皮汁更適合作為料酒發(fā)酵基液,有利于提高乙醇濃度并控制乳酸的積累。在料酒發(fā)酵過(guò)程中,可以將釀酒酵母作為乙醇的主要來(lái)源,而三種酵母菌的混合使用不會(huì)引起乳酸的大量積累。

通過(guò)研究初始葡萄糖和酵母浸粉濃度、三種酵母組合添加工藝等因素對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的殘?zhí)恰⒁掖己腿樗岱e累的影響,確定柑橘型料酒的最優(yōu)發(fā)酵初始條件為:1 L全柑橘肉汁中添加的160 g葡萄糖和10 g酵母粉;三種酵母的接種濃度和體積比例為2∶2∶2;組合酵母最佳添加順序?yàn)?釀酒酵母在發(fā)酵初期就加入,發(fā)酵24 h加入球擬酵母,并繼續(xù)發(fā)酵24 h后加入魯氏酵母。在此最適條件下靜置發(fā)酵168 h后,乙醇和乳酸的濃度分別達(dá)到145.00和0.11 mg/mL。本研究結(jié)果為柑橘料酒產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

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