生鮮食品中蠟樣芽孢桿菌毒力基因及耐藥性研究

田萬帆,張 榮,龍 虎,柳 琳,賀蘇皖,杜 玄,蔣 敏,趙 悅,唐俊妮

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都610041)

蠟樣芽孢桿菌在我國細菌性食物中毒中居前三位,是一種需氧、有芽孢、無莢膜、能運動的革蘭氏陽性桿菌。該菌廣泛存在于自然環境,是剩米飯、剩菜和涼拌菜等引起食物中毒的常見致病菌[1]。蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的毒力因子主要為非溶血性毒素(NHE)、溶血性毒素(HBL)、細胞毒素K、腸毒素FM及嘔吐毒素(Cereulide)。溶血毒素和非溶血性毒素都是由3個亞基構成的大分子蛋白,是引起腹瀉型食物中毒的主要原因,嘔吐毒素Cereulide是由(DOLeuDAlaLOValL-Val)3組成的十二肽,耐熱、耐酸堿、耐蛋白酶,可引起嚴重的橫紋肌溶解或者肝臟功能衰竭等疾病,也是引起蠟樣芽孢桿菌食物中毒的主要原因。腸毒素不耐熱,很容易失活,該類型食物中毒并不常見[23]。蠟樣芽孢桿菌的毒素可分為嘔吐型和腹瀉型,目前,針對毒力基因的檢測,嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的目標基因為ces和cer;腹瀉型蠟樣芽孢桿菌的目標基因為entFM,hbl,bceT,nhe和cytK[3]。蠟樣芽孢桿菌除引起食物中毒外,還可引發菌血癥、心內膜炎、腦膜炎等[4]。因此,了解生鮮食品中蠟樣芽孢桿菌攜帶的毒力基因,有助于掌握蠟樣芽孢桿菌的流行病學特征,同時通過對食品蠟樣芽孢桿菌分離株進行藥敏實驗,為合理選用抗生素治療食源性蠟樣芽孢桿菌引起的疾病提供依據。

本研究從成都市農貿市場、路邊小攤共采集100份生鮮食品樣品,分離鑒定食品中污染的蠟樣芽孢桿菌,并對其攜帶的毒力基因和耐藥性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養基(MYP)、大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)、MuellerHinton瓊脂(MHA) 青島高科園海博生物技術有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 杭州微生物試劑有限公司;TE緩沖溶液;TAE緩沖溶液;REGULAR AGAROSE G10型瓊脂糖 BIOWEST公司;GELVIEW核酸染料、DL2000 Marker 寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物 上海生工公司合成;25 mmol/L MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶 北京擎科新業生物技術有限公司;含藥紙片 Oxiod Limited公司;參考菌株:蠟樣芽胞桿菌CMCC(B)63303 上海復祥生物科技有限公司。

DYY6C型電泳儀 北京六一儀器廠;WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限公司;PTC200 PCR儀、Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀 BioRad公司;SWCJ2FD潔凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;UV6100分光光度計 上海美普達儀器有限公司;GHP9080水式恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司;HZQF160全溫振蕩培養箱 江蘇省太倉市實驗設備廠;AKHLⅢ24艾柯超純水機 (臺灣艾柯)成都康寧實驗專用純水設備;MLS3020電熱自動滅菌鍋 日本SANYO公司;5804 R型Eppendorf冷凍離心機 Eppendorf中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 食品樣本采集 在成都市附近的農貿市場和路邊小攤采集不同生鮮食品樣品100份(其中:農貿市場采集90份,路邊小攤10份,樣品包括:生肉類25份,蔬菜類44份,涼拌即食類14份,速凍食品類4份,米面制品類9份,全蛋2份,奶粉1份,鮮葡萄1份),每天采集的樣品立即送入實驗室進行分離鑒定。采樣時間為2014年7月至9月。

1.2.2 蠟樣芽孢桿菌的培養 分離和純化所有樣品均在無菌條件下進行處理。按照《食品衛生微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》(GB 4789.142014)進行檢驗,適當稀釋的培養物接種到MYP瓊脂平板上(30±1) ℃培養24～48 h,從MYP瓊脂平板上挑取疑似菌落,再次純化并進行鑒定。

1.2.3 蠟樣芽孢桿菌的16S rRNA測序鑒定 將純化的菌株和參考菌株CMCC(B)63303分別接種到TSB培養基中,37 ℃恒溫培養8～12 h,采用微波加熱法[5]提取菌株DNA。以細菌的16S rRNA通用引物進行PCR擴增,引物序列為:16S27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;16S1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT[6]。PCR反應體系:10×PCR緩沖液2 μL,Mg2+1.6 μL,dNTP混合液1.2 μL,Taq DNA聚合酶 0.2 μL,模板DNA 1 μL,引物各0.5 μL,無菌去離子水補足體積至20 μL。PCR反應程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 40 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 40 s,72 ℃ 7 min,35個循環。將擴增產物送至成都擎科生物公司進行測序比對。

1.2.4 蠟樣芽孢桿菌的毒力基因檢測 DNA模板的制備同上,蠟樣芽孢桿菌的檢測基因的引物序列和擴增片段長度詳見表1,PCR反應體系同上,退火溫度詳見表1,擴增產物采用瓊脂糖電泳和凝膠成像系統檢測。

表1 蠟樣芽孢桿菌的檢測基因引物Table 1 The primers of different genes for B. cereus

1.2.5 蠟樣芽孢桿菌的耐藥性 檢測藥敏實驗根據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)推薦的KB紙片擴散法進行操作,實驗結果按照CLSI 的標準進行判定。所用抗菌藥物及濃度見表2。

表2 18種抗生素藥物及其使用濃度Table 2 The concentration of different drugs used in this study

1.3 統計學分析

藥敏實驗每株菌和每個藥片平行重復3次,結果以平均值±SD表示,數據采用SPSS 19. 0統計軟件處理。

2 結果與分析

2.1 食品樣品中蠟樣芽孢桿菌的分離與鑒定結果

蠟樣芽孢桿菌在MYP培養基上的形態為粉紅色菌落,有2～5 mm沉淀環,菌落較大,表面較為干燥(詳見圖1)。通過形態學分離鑒定,初步得到24株菌株。進一步對24株菌株進行16S rRNA測序比對,比對結果也證實24株分離菌株均為芽孢桿菌屬。農貿市場樣品90份,檢出17份,檢出率為18.9%;路邊小攤采樣10份,檢出7份,檢出率為70%。路邊小攤食品中的蠟樣芽孢桿菌的檢出率遠高于農貿市場。并且分離的菌株大部分來自于米、面制品及涼拌即食類食品,詳見表3的采樣記錄。

圖1 蠟樣芽胞桿菌分離菌株在選擇性培養基MYP上的菌落形態及16S rDNA測序比對結果Fig.1 The colony morphology on MYP plate and the sequence analysis of 16 S rDNA of B. cereus isolates

表3 蠟樣芽孢桿菌分離的樣品來源Table 3 The sampling sources of B. cereus isolates

2.2 蠟樣芽孢桿菌的毒力基因檢測結果

根據PCR檢測結果,24株分離菌株在所檢測的毒力基因中,嘔吐型基因ces和cer的檢出率較低,僅在BC4中發現;腹瀉型基因nheC在24株中都有檢出;cytK有13株檢出;bceT有12株檢出;hblA有11株檢出;nheB有10株檢出;hblC、hblD、nheA各有9株檢出;hlyⅡ有7株檢出;hblB、entFM檢出率為0;蠟樣芽孢桿菌的看家基因rpoB、gyrB、groEL、vrrA在24株分離菌株中的檢出率為100%。參考菌株CMCC(B)63303中檢測出nheC基因和四個看家基因。另外,每株分離菌株至少攜帶1個以上的毒力基因,其中,BC2中攜帶9個,BC3和BC5菌株各攜帶8個,BC1攜帶7個,具體結果詳見表4。

表4 蠟樣芽孢桿菌分離菌株中毒力基因的分布情況Table 4 The distribution of different virulence genes in B. cereus isolates

2.3 蠟樣芽孢桿菌對18種藥物的敏感性檢測結果

根據藥物敏感性檢測和判定結果發現,24株被測蠟樣芽孢桿菌對18種抗生素存在不同程度的耐藥,藥物敏感譜詳見表5。從表5可以看出,24株蠟樣芽孢桿菌對桿菌肽B和磺胺甲亞唑兩種藥物的耐藥率為100%,對苯唑西林、青霉素耐藥率分別為96.2%,中介率為3.8%。對阿米卡星的耐藥率為0,中介率是19.2%,敏感率是80.8%。對亞胺培南、慶大霉素的耐藥率為7.7%,中介率為11.5%,敏感率為80.8%。對呋喃妥因、萬古霉素、頭孢西丁、利福平的耐藥性較相似,耐藥率分別為76.9%、65.4%、61.5%、56.7%,敏感率較低,為0和3.8%。對氧氟沙星、四環素、紅霉素、環丙沙星、克林霉素、鏈霉素、氯霉素的耐藥率較低均小于40%,且依次降低。

表5 蠟樣芽孢桿菌分離菌株對18種藥物的敏感性檢測結果Table 5 The results of antimicrobial susceptibility test for B. cereus isolates

3 結論與討論

近年來,蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒事件的報道逐年增加,其在不同食品中的檢測率也較高,如楊媛等[17]從原料乳中分離蠟樣芽孢桿菌,檢出率為33%;李毅等[18]從溫州地區不同食品中分離蠟樣芽孢桿菌,檢出率為57.4%;章樂怡等[19]從嬰幼兒奶粉、米粉的蠟樣芽胞桿菌中分離蠟樣芽孢桿菌,檢出率為71.79%。本研究中,我們一共從農貿市場和路邊小攤采集生鮮食品樣品100份,采樣種類豐富,這些食品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為24%。其中,路邊小攤檢出率(70%)遠遠高于農貿市場(18.9%)。并且,從我們的檢測結果來看,米面制品和涼拌食品中蠟樣芽孢桿菌的污染情況較為突出。蠟樣芽孢桿菌易污染米飯、米粉、涼面等含淀粉豐富的米面制品和涼拌食品[20],夏季涼拌食品所用的配料及原材料長時間暴露在環境中,所售賣的食品衛生難以保證,特別是路邊小攤的食品安全問題應當引起有關部門的注意。

針對24株分離菌株攜帶的毒力基因進行檢測,嘔吐型蠟樣芽孢桿菌檢測的目標基因ces和cer只在BC4分離株中發現,檢出率較低。盡管entFM基因在所有菌株中未檢出,但是引起蠟樣芽孢桿菌腹瀉的其他目標基因hbl,bceT,nhe和cytK在24株分離菌株中的檢測率偏高,要引起重視。四個看家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中都有檢出,也進一步驗證了分離菌株的鑒定情況。文獻研究表明溶血素hbl基因、非溶血性腸毒素nhe基因、細胞毒素cytK基因是引起腹瀉的主要毒力基因,腸毒素entFM基因、腸毒素bceT基因是潛在的腹瀉性毒力基因[21]。從我們的毒力基因檢測結果可以看出,本次研究所分離的這些菌株如果感染到人引起腹瀉的可能性較大,說明采樣的生鮮食品引起食物中毒的風險偏高。

24株菌株對桿菌肽B和磺胺甲亞唑兩種藥物的耐藥率為100%,對青霉素類藥物的耐藥性也較高。這可能與該地區這些抗生素的使用頻率有關聯。李毅等[18]對溫州地區2011～2012年食品中檢出的39株蠟樣芽孢桿菌進行藥敏檢測,他們的結果發現39株蠟樣芽孢桿菌對四環素和利福平的耐藥率較高。莊子慧等[22]對我國不同地區2011年收集的238株蠟樣芽孢桿菌進行藥敏實驗,結果發現食源性蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌對青霉素類藥物的抗性也較高。楊移斌等[23]針對羅非魚源分離的一株蠟樣芽孢桿菌進行研究,發現該菌株對苯唑西林、青霉素等10種抗生素耐藥。盡管這些不同地區不同來源分離的蠟樣芽孢桿菌的耐藥情況存在一定差異,但蠟樣芽孢桿菌食品源分離菌株的耐藥性卻不容忽視。

本研究結果為本地區的蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的風險評估和治療措施提供一定的參考價值。另外,建議有關部門加強對生鮮食品流通環節的管理,提升生鮮食品加工衛生水平,改進即食食品安全狀況。

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