香櫞多酚提取工藝優化

張 然,徐 敏,何婷婷,蔡 暢

(常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

香櫞(CitrusmedicaL.)為蕓香科柑橘屬植物,又名枸櫞子,《本草圖經》記載香櫞具有止咳化痰、理氣和中的作用[12]。現代醫學研究也發現香櫞在抑制動脈擴張和治療肝炎方面有顯著療效,香櫞名列2016年國家衛生計生委發布的《既是藥品又是食品的名單》中,是一種藥食兩用原材料。在我國大部分香櫞生長在云南、福建、浙江、江蘇、廣西、湖北等地[3],因其具有較強的觀賞價值,目前已發展成為江蘇和浙江兩省及上海市重要的庭院、道路綠化樹種,香櫞果實產量逐漸豐富,香櫞的食品產業開發有廣闊前景。香櫞中含有豐富的營養素和生物活性物質,目前國內對香櫞功效成分提取的研究主要在果膠、柚皮苷和揮發油組分方面[3],關于香櫞多酚提取的報道很少,植物多酚是植物中具有多元酚結構的物質,主要存在于植物的根、皮和果實中,是植物體內復雜酚類的次生代謝產物[46],現代研究認為植物多酚具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂及抗癌等生物學作用[7]。

本文以香櫞為主要原料,以乙醇為溶劑提取香櫞中多酚,并且對相應提取工藝進行優化,從而為香櫞食品深加工產業提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香櫞(干品) 江蘇龍升藥業有限公司;沒食子酸標準品 上海如吉生物對照品專用;福林酚試劑 蘇州晶茂生物科技有限公司;碳酸鈉 天津市永大化學試劑有限公司,乙醇 天津永大化學試劑有限公司;蒸餾水 實驗室自制。

紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;EL204型電子精密天平 梅特勒托利多儀器有限公司;HMS112型電熱式恒溫水浴鍋 江蘇金壇宏凱儀器廠;1011AB型電熱鼓風干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;HK20B型搖擺式高速中藥粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 香櫞55 ℃烘干4 h至恒重、中藥粉碎機打碎,過60目篩→精確稱量→加入一定濃度乙醇溶液→選擇一定溫度置于恒溫水浴鍋→浸提一定時間→過濾→水浴→收集香櫞多酚醇提液。

1.2.2 標準曲線的繪制 精確吸取0、1、2、3、4、5、6 mL 0.1 mg/mL沒食子酸溶液于10 mL容量瓶中,定容。再各取1 mL稀釋液于試管中,分別加入0.5 mL福林酚試劑與2 mL 10%的碳酸鈉,定容到10 mL,45 ℃水浴30 min,冷卻后用蒸餾水作為空白,可見分光光度計在765 nm下測得吸光度值,每個樣品平行測定三次。以沒食子酸標準溶液的濃度(mg/mL)為橫坐標,以吸光度值作為縱坐標,繪制相應的標準曲線,所得標準曲線的方程為:Y=10.604X+0.0117,R2=0.9998。

1.2.3 香櫞多酚得率計算 取1 mL提取后的溶液,分別滴加0.5 mL福林酚試劑與2 mL 10%的碳酸鈉溶液,用蒸餾水精確定容到10 mL,放置于45 ℃的水浴鍋中水浴30 min,于765 nm處測其吸光度,按照標準曲線測定香櫞中多酚濃度。多酚得率公式如下:

式中,C為提取液中多酚的濃度(mg/mL);V為提取液體積(mL);n為稀釋倍數,m為香櫞粉的質量(g)。

1.2.4 香櫞多酚提取的單因素實驗

1.2.4.1 乙醇體積分數對香櫞多酚得率的影響 按照料液比1∶20 g/mL,提取溫度70 ℃,提取時間60 min;以不同乙醇體積分數(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液為提取液,考察乙醇體積分數對香櫞多酚得率的影響。

1.2.4.2 料液比對香櫞多酚得率的影響 在乙醇體積為40%,提取溫度70 ℃,提取時間60 min條件下,分別選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL以研究不同料液比對香櫞多酚得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度對香櫞多酚得率的影響 在乙醇體積為40%,料液比為1∶15 g/mL,提取時間60 min條件下,分別選擇提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃以研究不同提取溫度對香櫞多酚得率的影響。

1.2.4.4 提取時間對香櫞多酚得率的影響 在乙醇體積為40%,料液比為1∶15 g/mL,提取溫度為60 ℃條件下,測定提取時間 40、60、80、100、120 min時香櫞多酚得率,研究不同提取時間對香櫞中多酚得率的影響。

1.2.5 香櫞多酚提取的正交實驗設計 以香櫞多酚得率為評價指標進行單因素實驗,在單因素實驗基礎上,設計四因素三水平正交實驗,確定提取香櫞多酚的最佳工藝,因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3 數據處理

實驗結果以均值±標準差(mean±SD)表示,每個處理重復3次,采用SPSS 19.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數對香櫞多酚得率的影響 由圖1可知,乙醇體積分數在30%到40%之間,香櫞多酚得率上升速度最快,乙醇體積分數40%時香櫞多酚得率達到最高,這可能是由于乙醇體積分數過低不利于有效成分的溶解和吸收。乙醇體積分數上升到40%以后,隨乙醇體積分數升高香櫞多酚得率反而下降。這可能是因為乙醇體積分數較大時,容易導致多酚類物發生醇解,而且葉綠素等物質溶出也增多,干擾因素的影響也增強,導致香櫞多酚得率反而下降[8]。因此乙醇的適宜濃度為40%。

圖1 乙醇體積分數對香櫞多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentvation on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.注:不同小寫字母代表組間差異顯著(p<0.05),圖1～圖4同。

2.1.2 料液比對香櫞多酚得率的影響 由圖2可知,在料液比由1∶10 g/mL到1∶15 g/mL時,香櫞多酚得率迅速上升,料液比在1∶15 g/mL達到最高值為23.53 mg/g,當料液由1∶15 g/mL到1∶30 g/m時,香櫞多酚得率緩慢下降。料液比為1∶15 g/mL時,多酚得率最高,與其他料液比相比多酚得率差異顯著(p<0.05)。因此,1∶15 g/mL為適宜料液比。

圖2 料液比對香櫞多酚得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.

2.1.3 不同提取溫度對香櫞多酚得率的影響 由圖3可知,隨著提取溫度的升高,香櫞多酚的得率先上升后下降,60 ℃時達到最高。這是由于提取溫度上升引起分子加速運動,導致多酚加速滲出,因此表現為香櫞多酚得率上升[9];當溫度升高到60 ℃時,香櫞多酚得率開始下降,這可能是由于多酚的熱穩定性較差,長時間受熱發生氧化水解。因此60 ℃為適宜提取溫度。

圖3 提取溫度對香櫞多酚得率的影響 Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.

2.1.4 不同提取時間對香櫞多酚得率的影響 由圖4可知,提取時間在40 min至100 min時,隨提取時間延長,香櫞多酚得率逐漸升高,在100 min時香櫞多酚得率到達最大值24.59 mg/g,與其它提取時間存在顯著差異(p<0.05),提取時間大于100 min后隨提取時間的延長香櫞多酚得率反而逐漸減少,這可能是因為隨時間延長香櫞多酚氧化受損引起的[1011]。因此,100 min為適宜提取時間。

圖4 提取時間對香櫞多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.

2.2 正交實驗

根據極差R的大小,判斷香櫞多酚提取的各因素影響作用由強至弱為:B>C>A>D(即料液比>提取溫度>乙醇體積分數>提取時間)。表2可以看出提取香櫞多酚的最佳工藝為A1B3C3D2,即乙醇體積分數30%,料液比1∶20 g/mL,提取溫度70 ℃,提取時間100 min。

表2 正交實驗結果Table 2 Experimental design and result of orthogonal experiments

2.3 驗證實驗

在最佳工藝條件下:1 g香櫞,20 mL體積分數為30%的乙醇溶液于70 ℃水浴鍋中提取100 min,重復三次,計算平均值,見表3,該條件下香櫞多酚得率為40.13 mg/g。

表3 驗證實驗結果Table 3 Experimental resuts of verify tests

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗,確定了從香櫞中提取多酚的最佳工藝參數為:乙醇體積分數30%,料液比1∶20 g/mL,提取溫度70 ℃,提取時間100 min,在此最優條件下,多酚得率為 40.13 mg/g。本實驗為香櫞的進一步純化和活性研究奠定了基礎,也為香櫞的綜合利用提供技術參考依據。

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