高效液相色譜法檢測乳中β-內酰胺酶抑制劑他唑巴坦

于國萍,范美婧,郭佩佩,陳 媛,劉 鵬,董良偉

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

他唑巴坦(Tazobactam)屬半合成青霉烷砜類衍生物,是以舒巴坦為原料化學合成的,抑酶作用更強,是一種應用廣泛的β內酰胺酶抑制劑[12],具有廣譜的β內酰胺酶抑制作用[3]。

抗生素常用來治療牛乳房炎,避免不了殘留在牛乳中,而不法商販通過添加β內酰胺酶進行掩蓋[45];隨著β內酰胺酶檢測方法的出現,有些人利用β內酰胺酶抑制劑不可逆地與β內酰胺酶結合的性質,在乳中添加β內酰胺酶抑制劑,使該酶失去活性,導致含有β內酰胺酶的奶不能被檢測出來[68];所謂不可逆競爭性抑制劑,是因為它們進行正常的水解反應時,產生一些中間產物導致的。有研究表明,他唑巴坦會導致一些過敏反應,例如皮疹、藥熱等,嚴重危害消費者身體健康[910]。

國內外關于β內酰胺酶抑制劑的檢測方法多集中于生物樣品[1113]、臨床醫療[1416]等方面,而關于β內酰胺酶抑制劑的檢測方法又主要集中在分光光度法[17]、微生物法[18]、毛細管電泳法[19]、高效液相色譜質譜[9]、高效液相色譜法[20]等。在乳制品中關于β內酰胺酶抑制劑的檢測還沒有現行的標準發布,因此建立具有推廣性的檢測方法已經迫在眉睫。

本文利用高效液相色譜法建立了乳中β內酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測方法,該方法實用性及推廣性較強、操作簡便,這對于保證乳制品的質量,維護消費者健康權益具有十分重要的現實意義和指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

他唑巴坦標準品 美國sigma公司;乙腈、甲醇、正己烷 均為色譜純,瑞典歐森巴克化學公司;四丁基氫氧化銨、磷酸氫二鉀 天津市天力化學試劑有限公司;超純水 娃哈哈純凈水;原料乳 哈爾濱周邊奶牛場。

Hypersil ODS2 C18色譜柱 美國Thermo Fisher公司;Waters 2487高效液相色譜儀、Waters 2487紫外吸收檢測器 美國Waters公司;FE28型pH計、AL204電子天平 梅特勒儀器有限公司;MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;LD42A型臺式低速離心機 北京眾益中和生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:流動相A:乙腈;流動相B:取5 mL 5 mmol/L的四丁基氫氧化銨與995 mL 0.03 mol/L磷酸二氫鉀混合,調整pH為5;A∶B為(10∶90);檢測波長:213 nm;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;

1.2.2 樣品前處理方法 用移液器取1 mL牛奶與4 mL乙腈于10 mL離心管中進行混合,60 s振蕩混勻后,4000 r/min離心15 min,取2 mL上清液與3 mL正己烷于另一10 mL離心管中進行混合,60 s振蕩混勻后,4000 r/min離心8 min,棄去上面的正己烷層,剩余液體用40 ℃氮氣吹干后定容至1 mL,過0.45 μm有機系微孔濾膜后,按照上述最佳色譜條件進行上機實驗進行分析測定。

1.2.3 加標樣品前處理方法 分別取5、50、100 μL 濃度為1 mg/mL的他唑巴坦標準溶液加入到1 mL牛奶樣品中,然后進行樣品前處理(同1.2.2)。

1.2.4 色譜條件的優化 依據前期實驗結果,確定乙腈為沉淀蛋白溶劑,正己烷為脫脂溶劑。在此基礎上進行流動相的優選。

1.2.4.1 流動相選擇及配比的優化 流動相的選擇,對比了甲醇水(10∶90)和乙腈水(10∶90)兩種不同流動相體系在同等條件下對他唑巴坦分離的效果,通過上機實驗選擇合適的有機相;根據所選擇的有機相,優化配比,分別選擇有機相與水的比例為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50,上機實驗進行測定。

1.2.4.2 緩沖溶液的選擇及濃度的優化 在色譜分析中,緩沖溶液的添加,可以起到防止樣品解離、峰型拖尾、增加方法的可靠性等作用。緩沖溶液的種類較多,比如酸類:醋酸,磷酸等緩沖液;堿類:三乙胺,二乙胺;鹽類的:磷酸二氫鉀,酸酸氫二鉀等[2123]。本實驗在水相中添加濃度為0、5、10、15、20 mmol/L 四丁基氫氧化銨和濃度為0、0.015、0.03、0.06、0.12 mol/L的磷酸氫二鉀兩種緩沖溶液,考察了緩沖溶液及濃度對他唑巴坦分離效果的影響。

1.2.4.3 緩沖溶液pH的優化 緩沖溶液的pH會影響樣品的分析效果,若pH的選擇不恰當會導致分裂峰、不對稱峰、肩峰或寬峰等;本實驗利用0.05 moL/L的磷酸調節pH為3、4、5、6、7,考察他唑巴坦保留時間及分離效果受緩沖溶液pH的影響。

1.2.5 標準曲線與檢測限 本實驗采用流動相稀釋標準溶液作標準曲線,分別用流動相逐步稀釋濃度為1 mg/mL的他唑巴坦標準溶液,將其變成濃度為5、10、50、100、150、200 (g/mL標準溶液后,按上述最佳色譜條件上機實驗進行測定。

1.2.6 回收率與精密度 實驗采用空白加標的方法進行回收率和精密度測定。在空白牛奶樣品中分別添加濃度為5、50、100 μg/mL的他唑巴坦標準溶液后,在最佳色譜條件下進行上機加標回收實驗,并依據公式:回收率(%)=樣品測定值/標準加入量×100進行計算,每個濃度平行測定6次。

1.2.7 實際樣品的測定 本實驗通過采用β內酰胺酶商品化試劑盒,測定抑制β內酰胺酶的最低的他唑巴坦的添加量。

1.3 數據處理

本論文采用Origin繪圖工具,SPSS Statistics 19.0數據統計分析。其中單因素方差分析(ANOVA)中采用Duncan檢驗,圖表中的字母表示差異顯著性分析的結果。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相選擇及配比的優化 首先對比了甲醇水(10∶90)和乙腈水(10∶90)兩種不同流動相體系在同等條件下對他唑巴坦分離的效果,結果如圖1所示,以甲醇水體系(圖1a)為流動相時,色譜峰峰形較差,他唑巴坦得不到理想的分離效果,而用乙腈代替甲醇(圖1b)作為流動相后,則峰形較好,改善了分離效果。因此,本實驗選擇流動相為乙腈水體系,并進一步考察乙腈與水不同配比時,對待測物質分離效果的影響,實驗結果如圖2所示。

圖1 兩種流動相的色譜圖Fig.1 The chromatogram of two mobile phase注:a、b分別為甲醇水、乙腈水為流動相的色譜圖。

圖2 不同乙腈含量的色譜圖Fig.2 The chromatogram of different acetonitrile content注:a～e表示乙腈與水的比例分別為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50。

由圖2可知,乙腈含量升高,可提高檢測的靈敏度,但隨著乙腈含量升高,保留時間減小,使他唑巴坦的分離效果較差，而乙腈含量降低,可增大他唑巴坦的保留時間,并得到很好的分離結果。通過前期的預實驗發現,當乙腈濃度低于10%時,分離效果沒有達到最佳狀態,他唑巴坦和雜質沒有完全分開,這可能是二者比例的改變,導致流動相極性的改變,不利于他唑巴坦和雜質的分開。因此選擇乙腈∶水=10∶90比例時較為適宜。

2.1.2 緩沖溶液的選擇及濃度的優化 由圖3可知,他唑巴坦的保留時間隨著添加四丁基氫氧化銨溶液濃度的增加而延長,雖然增加的效果不顯著,但色譜分離效果明顯改善,表明加入四丁基氫氧化銨后能夠增加其在色譜柱上的保留能力,所以在保證他唑巴坦與相鄰組分有效分離的條件下,本實驗采用添加四丁基氫氧化銨溶液的濃度為5 mmol/L。

圖3 優化四丁基氫氧化銨濃度的色譜圖Fig.3 Optimize the tetrabutylammonium hydroxide of concentration of potassium dihydrogen phosphate注:a～e表示四丁基氫氧化銨的濃度分別為0、5、10、15、20 mmol/L。

添加磷酸二氫鉀對他唑巴坦保留時間的影響見圖4,可以看出,隨著添加磷酸二氫鉀溶液濃度的增大,色譜圖中的保留時間也增大,但考慮色譜柱對有機鹽濃度的限制,應選擇鹽濃度相對較低的緩沖溶液添加到流動相中,但是必須保證能夠有效分離。因此,本實驗確定添加磷酸二氫鉀的濃度為0.03 mol/L。

圖4 優化磷酸二氫鉀濃度的色譜圖Fig.4 Optimize the chromatogram of concentration of potassium dihydrogen phosphate注:a～b表示磷酸二氫鉀的濃度分別為0、0.0125、0.03、0.06、0.12 mol/L。

2.1.3 緩沖溶液pH的優化 實驗結果如表1所示,他唑巴坦的保留時間隨著緩沖溶液pH的減小而逐漸增加,且pH越低,分離效果越好。當pH為5時,色譜峰峰形窄且對稱,無拖尾現象,分離效果也好。因此,本實驗選擇pH為5。

表1 pH與保留時間的關系Table 1 The relationship between pH and retention time

2.2 方法學的驗證

2.2.1 系統適用性 在上述最佳色譜條件下,他唑巴坦標準溶液和原料乳中添加他唑巴坦溶液的色譜圖,分別如圖5和圖6所示。

圖5 最佳色譜條件下他唑巴坦標準溶液的色譜圖Fig.5 The chromatogram of tazobactam standard solution under the best chromatographic condition

圖6 最佳色譜條件下原料乳中添加他唑巴坦的色譜圖Fig.6 The chromatogram of tazobactam spiked in milk under the best chromatographic condition

從圖5和圖6可以看出,最佳色譜條件下,他唑巴坦標準溶液的保留時間為5.287 min,原料乳中添加他唑巴坦的保留時間為5.284 min,他唑巴坦標準溶液和樣品中他唑巴坦峰的主峰保留時間基本一致,且在原料乳中,他唑巴坦與雜質得到很好的分離效果,表明最佳色譜條件,即色譜柱為Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相A為乙腈;流動相B為取5 mL 5 mmol/L的四丁基氫氧化銨與995 mL 0.03 mol/L磷酸二氫鉀混合,調整pH為 5;A∶B為(10∶90);檢測波長為213 nm;流速為1 mL/min;進樣量為10 μL;此條件適用于乳中他唑巴坦的檢測。

2.2.2 標準曲線與檢測限 本實驗是采用流動相稀釋標準溶液作標準曲線,結果如圖7所示,可以看出,標準溶液回歸方程為:y=17429x4330,相關系數為0.9993,表明在0.5～200 g/mL的濃度范圍內他唑巴坦與其峰面積呈正相關,線性關系良好;按照最小檢出限的定義,在信噪比3∶1時,確定他唑巴坦的最小檢出限為0.07 g/mL,達到日常分析要求。

圖7 他唑巴坦的標準曲線Fig.7 The standard curve of tazobactam

2.2.3 回收率與精密度 結果如表2所示，該方法的回收率在88.40%～94.18%之間,滿足加標回收實驗要求;而相對標準偏差小于等于1.57%,表明本法的精密度良好。

表2 乳中他唑巴坦的加標回收率及精密度(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of tazobactam spiked in milk(n=6)

2.2.4 實際樣品的測定 本實驗室通過利用β內酰胺酶商品化試劑盒,確定了抑制β內酰胺酶所需的最低添加量為15 μg/mL,落在本研究所建立的HPLC方法的檢測范圍內。按照此法對目前市場上的原料乳進行測定,并對樣品添加15 μg/mL他唑巴坦標準溶液進行對比分析,結果如表3所示。從表中可以看出,樣品均未檢出β內酰胺酶抑制劑他唑巴坦,15 μg/mL他唑巴坦加標回收率的平均值為89.96%±0.48%。

表3 用當前的方法分析不同牛奶樣品中他唑巴坦的含量Table 3 Analysis of tazobactam in different milk samples using the proposed method

3 結論

本實驗建立并驗證了測定乳中β內酰胺酶抑制劑他唑巴坦的高效液相色譜的檢測方法。樣品采用乙腈作為沉淀蛋白溶劑,正己烷作為脫脂溶劑,確定了最佳色譜條件。結果表明他唑巴坦在0.5～200 μg/mL的濃度范圍內具有良好的線性關系,最小檢出限為0.07 μg/mL,采用空白基質匹配標準溶液的方法進行標準校正,顯示他唑巴坦的平均回收率在88.40%～94.18%之間,相對標準偏差小于1.57%。表明該方法適用于乳中β內酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測,測定結果準確可靠并具有一定的推廣價值,還可為監管部門管理乳制品市場提供有力依據。

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