飲用水中亞硝酸鹽高通量檢測微孔板法的研究

劉鳳銀,張媚健,李 軒,謝麗君,袁學文,黃燕璇,梁 岳,穆洪濤,*

(1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院,廣東廣州 510310;2.中國醫學科學院藥物研究所,北京 100050;3.廣東第二師范學院化學系,廣東廣州 510310)

亞硝酸鹽具有氧化性,常作為護色劑、防腐劑被廣泛應用于食品行業中[13]。但研究發現,亞硝酸鹽可使血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,失去運氧的功能,短期大量攝入可導致組織缺氧甚至死亡[45]。此外,亞硝酸鹽可與體內的胺類物質反應生成“亞硝胺”,后者具有致癌作用,長期過量攝入易誘發食道癌、胃癌和腸癌等[6]。亞硝酸鹽作為生態系統中氮循環的一個自然組成部分,廣泛存在于天然水體中。但工業廢水、水產養殖業、運輸管道等污染,會導致水體中亞硝酸鹽含量大幅度升高[78]。世界衛生組織規定每日允許亞硝酸鹽攝入量不得超過0.2 mg/kg·bw[9];我國衛生部2017年出臺的《食品安全國家標準食品中污染物限量》,規定礦泉水中亞硝酸鹽含量不能超過0.1 mg/L[10]。

我國對食品安全高度重視,隨著抽檢覆蓋率提高,快速檢測作為實驗室檢測的有益補充,可實現大量樣品的現場篩查,增加樣品檢測數量,擴大食品安全控制范圍,大大提高監管效率[1112]。目前已報道的亞硝酸鹽快速檢測方法主要有試紙法[1315]和速測管法[16],它們都具有快速、簡便等優點,但靈敏度低,只能定性或半定量檢測,且無法進行高通量檢測,限制了應用。鄭曉宏等報道了一種微孔板法,實現了對亞硝酸鹽的定量、高通量檢測,但該方法采用氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺雙顯色劑,但步驟多、操作繁雜、耗時長、干擾因素多等[17]。李永芳等[18]研究發現,間苯二胺可獨立作為重氮化偶聯試劑,用于亞硝酸鹽的檢測,其原理是利用間苯二胺的兩個伯氨基,其中一氨基先與亞硝酸鹽發生重氮化反應生成重氮鹽,再利用分子的另一氨基,發生分子內偶聯反應,生成橙紅色環偶氮亞氨基苯，該研究采用單一試劑作為重氮化偶聯試劑,具有靈敏、快速、穩定、操作簡便等優點,但無法實現高通量檢測。

本研究擬以微孔板為載體,采用間苯二胺作為顯色劑,通過確定最佳測定波長、優化工作條件,以期建立一種高通量檢測方法,用于飲用水等食品中亞硝酸鹽殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞硝酸鈉 優級純;間苯二胺、鹽酸、亞硫酸鈉、亞鐵氰化鉀、碘化鉀、氯化鈣、氯化鈷、氯化鋁、硫酸鎳、氯化銨、氯化鎂、溴化鈉、乙酸鋅、硝酸鈉、硼酸鈉、硫酸銅、氯化鉻 均為分析純;實驗用水 屈臣氏蒸餾水。

SPMax 2300A2光吸收型全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司;JA2603B(M)分析天平(0.1 mg) 上海精科科學儀器有限公司;微量移液器 德國艾本德股份公司;DHG9140AD鼓風干燥箱 上海東麓儀器設備有限公司;96孔微孔板 廈門怡佳美實驗器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最佳測定波長確定 將間苯二胺用0.5 mol/L鹽酸溶解稀釋,配制間苯二胺顯色劑(20 g/L)。以96孔微孔板為載體,使用移液器將5 mg/L亞硝酸鈉標準溶液、間苯二胺顯色劑加入微孔板中混合,兩者的體積比為1∶9,分別為25、225 μL。反應10 min后,對反應后的體系在400～800 nm處進行全波長掃描。選擇吸光值最大的波長作為最佳測定波長。

1.2.2 單因素實驗 與5 mg/L亞硝酸鈉標準溶液進行顯色反應,采用酶標儀,測定各孔吸光值A451 nm。固定間苯二胺顯色劑濃度為20 g/L,反應時間為10 min,考察鹽酸濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)對顯色效果的影響;固定鹽酸濃度為0.4 mol/L,反應時間為10 min,考察顯色劑濃度(10、20、30、40、50、60 g/L)對顯色效果的影響;固定鹽酸濃度為0.4 mol/L,間苯二胺顯色劑濃度為30 g/L,考察反應時間(2、5、10、15、20、30 min)對顯色效果的影響。

1.2.3 正交實驗 以鹽酸濃度、顯色劑濃度、反應時間為考察因素,吸光值A451 nm為指標,根據單因素實驗的結果,進行3因素3水平正交實驗。正交實驗因素水平設置見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 標準曲線的建立 配制0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、5 mg/L亞硝酸鈉標準溶液,在最佳顯色條件下進行顯色反應。以亞硝酸鈉濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.6 檢出限 吸取20份空白水樣,進行測定。計算空白值的平均值B0及其標準差SDB0。按照下式計算檢出限(LOD)。

LOD=B0+3SDB0

式(1)

1.2.7 空白添加回收實驗 取18等份空白水樣分為3組進行6等份樣品平行實驗,分別以0.05、0.10、0.15 mg/L三個不同亞硝酸鈉濃度水平進行測定。按照以下公式計算空白加標回收率及變異系數。

式(2)

式(3)

1.3 數據處理

實驗做3個平行實驗,實驗數據采用平均值±標準差的形式表示。采用Excel計算數據平均值及標準差;采用SPSS 19.0進行正交實驗設計及數據方差分析;采用Origin 8.5對數據進行擬合分析。

2 結果與分析

2.1 最佳測定波長確定

由圖1可知,反應后體系在451 nm處具有最大吸收峰。因此,選擇451 nm作為最佳測定波長。

圖1 反應產物吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectrum curve of reaction product

2.2 工作條件優化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 鹽酸濃度對顯色效果的影響 亞硝酸鹽與間苯二胺重氮化顯色反應需在強酸條件下進行,鹽酸濃度會影響顯色反應的效果。吸取5 mg/L亞硝酸鈉標準溶液在不同鹽酸濃度下進行顯色反應,采用酶標儀于451 nm處測定吸光值,結果見圖2。隨著鹽酸濃度的升高,吸光值先增大后減小,0.4 mol/L時,反應最為充分,吸光值最大。

圖2 鹽酸濃度對顯色效果的影響Fig.2 Effect of concentration of hydrochloric acid on chromogenic reaction注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖3、圖4同。

2.2.1.2 顯色劑濃度對顯色效果的影響 吸取5 mg/L亞硝酸鹽標準溶液與不同濃度的間苯二胺顯色劑進行顯色反應,結果見圖3。在間苯二胺濃度為30 g/L時,具有穩定最大吸光值,濃度低或者高于30 g/L時,吸光值逐漸減小。可能原因是,顯色劑濃度過低,顯色不充分,吸光值偏低;顯色劑濃度過高,過量的顯色劑被空氣氧化為褐色,對實驗測定產生了干擾,吸光值降低[19]。

圖3 顯色劑濃度對顯色效果的影響Fig.3 Effect of concentration of chromogenic agent on chromogenic reaction

2.2.1.3 反應時間對顯色效果的影響 由圖4可知，反應時間過短,顯色不充分;反應時間過長,延長了檢測時間,不利于快速檢測需要。當顯色反應10 min后,反應完全,吸光值達到最大值,且在實驗時間內保持穩定。

圖4 反應時間對顯色效果的影響Fig.4 Effect of time on chromogenic reaction

2.2.2 正交實驗 根據單因素實驗結果,以鹽酸濃度、顯色劑濃度、反應時間為考察因素。進行L9(33)正交實驗。正交實驗直觀分析表見表2,方差分析表見表3。由極差分析結果可知,對顯色效果影響的主次順序為:B>A>C,即顯色劑濃度>鹽酸濃度>反應時間。由方差分析表可知,顯色劑濃度對方法靈敏度影響顯著,鹽酸濃度、反應時間對靈敏度影響不顯著。由k值大小可知,優化工作條件組合為A2B2C2,此結果與單因素實驗篩選出的最佳條件組合一致。此組合在表2中未出現,正交實驗均值最高組合為A2B2C3,比較兩組合差異在于反應時間。由于反應時間對靈敏度影響不顯著,為節約檢測時間,確定最佳工作條件組合為A2B2C2,即鹽酸濃度為0.4 mol/L,間苯二胺顯色劑濃度為30 g/L,反應時間為10 min。進一步重復實驗表明,該工作條件下,反應穩定性良好，A451 nm為2.5462。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交實驗方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment

2.3 標準曲線繪制

在最佳工作條件下,吸取一系列濃度梯度的亞硝酸鈉標準溶液進行顯色反應,在451 nm處測定吸光值,繪制標準曲線,見圖5。線性范圍為0～5 mg/L。

圖5 亞硝酸鈉測定標準曲線Fig.5 Standard curvefor nitrite determination

2.4 共存離子干擾實驗

2.5 檢出限

國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)規定,檢出限是一個分析方法能夠可靠地檢測出被分析物的最低濃度[20]。吸取20份空白水樣,進行測定。計算得檢出限為0.017 mg/L。

2.6 空白添加回收實驗

添加回收率常用來評價一個分析方法的準確度[21]。分別以0.5、1.0、1.5倍允許限量,即0.05、0.10、0.15 mg/L三個濃度水平進行添加,添加量在方法的線性范圍內。澄清水樣可直接取樣檢測。測定結果見表4。可以看出,空白加標回收率在95.24%～103.98%之間,變異系數<5%。說明,本研究所建立的亞硝酸鈉微孔板法具有良好的準確度和精密度。

表4 空白加標回收率測定Table 4 Recoveries of nitrite from spiked samples

3 結論

本研究基于亞硝酸鹽可與間苯二胺在強酸性條件下發生重氮化偶聯反應,生成橙紅色偶聯產物環偶氮亞氨基苯的原理,建立了一種微孔板法,可用于飲用水等食品中亞硝酸鹽殘留量的高通量定量測定。該微孔板法以間苯二胺為顯色劑,最佳測定波長為451 nm;最佳工作條件為鹽酸濃度為0.4 mol/L、間苯二胺濃度為30 g/L、反應時間為10 min;檢出限為0.017 mg/L,線性范圍為0～5 mg/L。該微孔板法具有快速、靈敏,可實現高通量檢測等優點,可用于飲用水等食品中亞硝酸鹽殘留量的現場快速高通量檢測,可進一步開發為商品化試劑盒,具有良好的社會效益和經濟效益。

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