高效液相色譜法測定甘藍泡菜發酵過程中的有機酸

王芮東,李 楠,衛博慧,史 露

(1.運城學院理科實驗中心,山西運城 044000;2.運城學院生命科學系,山西運城 044000)

泡菜,是以新鮮蔬菜為原料,經乳酸菌發酵而成的一種低鹽發酵食品[14]。它含有豐富的維生素、氨基酸[5],及乳酸、乙酸、蘋果酸等多種有機酸[69],其酸鮮純正、脆嫩芳香,具有解膩開胃等多種功效,受到眾多消費者的青睞,其中,有機酸是反映泡菜發酵程度的重要指標,可以提高泡菜的風味,其含量的多少與泡菜的品質密切相關。

目前,有機酸定量分析的方法有滴定法、氣相色譜法(GC)、毛細管電泳法(CE)、薄層色譜法、離子排斥色譜法(IC)、高效液相色譜法(HPLC)等[1015],其中HPLC法因具有高效快速、靈敏度高、穩定性好等優點而被普遍的使用,目前HPLC法用于分析泡菜中有機酸的研究較少,劉冬梅等[16]用高效液相色譜法對泡菜中L乳酸和D乳酸進行手性分離和測定,王冉等[17]用反相高效液相色譜法測定泡菜中的7種有機酸含量。這些方法測定的有機酸種類偏少,不利于更好檢測泡菜中的有機酸種類及含量。

本實驗建立了HPLC法同時測定泡菜中9種有機酸含量的方法,并對甘藍泡菜在自然發酵過程中有機酸的種類和數量進行了研究,還對其總酸、pH變化進行了分析,以期為改善泡菜的營養價值、口感風味及泡菜生物功能檢測提供理論依據,從而更好地控制泡菜生產過程和產品品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘藍、白砂糖、蒜、姜、辣椒、花椒、大料等 運城市華聯超市;海藻精制加碘鹽 中鹽上海市鹽業公司;磷酸二氫鉀、磷酸、氫氧化鈉、檸檬酸、琥珀酸 均為分析純,天津市大茂化學試劑廠;95%乙醇、草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、抗環血酸、丙酸 均為分析純,天津市瑞金特化學品有限公司;甲醇 色譜純,天津市大茂化學試劑廠。

LC1200型高效液相色譜儀(VWD紫外檢測器) 美國Agilent公司;PHS3E型pH計 上海佑科儀器有限公司;TDL6M型大型離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;JJ/2型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;TG16MW臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;KQ-300GDV型數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜制備 原料選擇及預處理:挑選新鮮、無蛀蟲、無腐爛的甘藍為原料,洗凈、晾干、切分。

鹵水配制:將水燒開,加入鹽、糖配制成鹽、糖濃度分別為6%、4%的溶液,冷卻至室溫。

裝壇:按甘藍菜與鹵水質量比1∶2的比例進行裝壇,并加入蒜、姜、花椒等輔料。

密封發酵:密封,室溫條件下發酵11 d。

1.2.2 有機酸測定方法的建立

1.2.2.1 有機酸提取 參照葉秀娟等[18]的方法并加以改進。準確稱取發酵的泡菜和汁液各10 g,一起放入組織搗碎機中搗碎成漿,然后以3850 r/min離心10 min,準確吸取上清液10 mL加15 mL超純水,于70 ℃超聲波中提取15 min,再以12000 r/min離心10 min,上清液經0.22 μm濾膜過濾后,置于2 mL樣品瓶中待色譜測定。

1.2.2.2 色譜條件 色譜柱:Agilent TCC18(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測器:VWD檢測器;流動相:甲醇0.01 mol/L磷酸二氫鉀(3∶97)(用磷酸調節pH=2.80);檢測波長:210 nm;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:25 ℃。

1.2.2.3 標準曲線繪制 精密稱取草酸、抗壞血酸各18 mg,蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸各300 mg,酒石酸75 mg,丁二酸700 mg,丙酸3000 mg,用甲醇與0.01 mol/L磷酸二氫鉀體積比為3∶97的溶液溶解并定容至50 mL的容量瓶,得到0.36 mg/mL的草酸、抗壞血酸、6 mg/mL蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、1.5 mg/mL酒石酸、14 mg/mL丁二酸、60 mg/mL丙酸的有機酸標準儲備液。將其用流動相稀釋為2、4、6、8、10、12倍,得到不同濃度梯度的有機酸標準溶液,經0.22 μm濾膜過濾至2 mL進樣瓶中,進樣分析,繪制峰面積質量濃度標準曲線,求回歸方程和相關系數。

1.2.2.4 精密度測定 取有機酸標準儲備液稀釋10倍后的標準溶液連續進樣6次,根據所得峰面積分別計算其精密度(以相對標準偏差表示)。

1.2.2.5 重復性測定 精密稱取同一份樣品6份(每份泡菜和汁液各10 g),分別預處理后進行色譜分析,計算相對標準偏差。

1.2.2.6 回收率測定 精密稱取發酵第6 d的樣品泡菜和汁液各10 g,按1.2.2.1方法制備有機酸提取液,準備同一有機酸提取液2份(各5 mL),其中1份作為本底,另1份添加有機酸標準溶液5 mL,分別預處理后進行色譜分析,計算各有機酸的加標回收率。

1.2.3 樣品的測定

1.2.3.1 有機酸含量測定 按照1.2.2的方法,對第0～11 d的泡菜樣品各有機酸含量進行測定,每個樣品平行3次,求平均值。

1.2.3.2 總酸度測定 采用酸堿滴定法[19],每個樣品平行3次,求平均值。

1.2.3.3 pH測定 采用精密pH計測定[20],每個樣品平行3次,求平均值。

1.3 數據分析

在Agilent ChemStion工作站,根據色譜圖中各峰的保留時間和內標法進行定性分析,根據峰面積和標準曲線對樣品中有機酸進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 有機酸標準混合液HPLC分析

在上述色譜條件下,有機酸標準混合溶液的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 有機酸混合標樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of organic acid standards注:蘋果酸有D蘋果酸和L蘋果酸兩種結構,二者總量記為蘋果酸總量。

由圖1可知,9種有機酸的出峰情況為:草酸(3.311 min)、酒石酸(3.737 min)、蘋果酸(D蘋果酸：4.746 min、L蘋果酸：9.388 min)、抗壞血酸(5.316 min)、乳酸(5.527 min)、乙酸(5.945 min)、檸檬酸(8.402 min)、丁二酸(10.034 min)、丙酸(13.643 min)。

2.2 標準曲線繪制

以各有機酸組分質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得到各有機酸的回歸方程及相關系數,結果見表1。

表1 有機酸標準曲線的線性參數Table 1 Regression equations and correlation coefficients for organic acids

由表1可知,9種有機酸在0.030～7.000 mg/mL線性范圍內,相關系數(R2)在0.9917～0.9996,表明各有機酸的峰面積與質量濃度的線性相關性良好,此條件下可以很好地測定有機酸含量。

2.3 精密度

由表2可知,9種有機酸的相對標準偏差(RSD)范圍在0.06%～0.26%,表明該方法的精密度良好。

表2 測定方法的精密度(n=6)Table 2 Precision of the method(n=6)

2.4 重復性

由表3可知,該方法6次實驗的RSD在0.67%～4.85%之間,表明該方法的重復性均達到分析要求。

表3 測定方法的重復性(n=6,mg/mL)Table 3 Repeatability of the method(n=6,mg/mL)

2.5 回收率

由表4可知,9種有機酸的回收率為95.23%～104.76%之間,說明該方法的準確度較高。

表4 有機酸加標回收率Table 4 Recovery of the organic acids

2.6 泡菜樣品中有機酸的測定結果

泡菜發酵第3 d的樣品色譜圖見圖2,第0～11 d泡菜樣品中有機酸組成及含量見表5。

表5 發酵過程中泡菜樣品有機酸含量(mg/mL)Table 5 Contents of each organic acid in kimchi during fermentation(mg/mL)

圖2 泡菜第3 d的有機酸的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of organic acids at the third day in kimchi

由圖2可知:第3 d中泡菜樣品中有機酸:草酸(3.415 min)、酒石酸(3.858 min)、蘋果酸(4.728 min)、抗壞血酸(5.042 min)、乳酸(5.495 min)、乙酸(6.411 min)、檸檬酸(7.512 min)、丁二酸(10.129 min)、丙酸(12.621 min)。

從表5可以看出,泡菜發酵過程中有機酸的種類及含量隨發酵時間延長而一直變化。在發酵第0 d未檢測到丙酸,第1 d后9種有機酸均被檢測到;發酵過程中草酸含量一直最高,乳酸次之;草酸含量在第0～6 d呈下降趨勢,第6 d后變化不大;酒石酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸與丁二酸從第0 d至5～7 d呈上升趨勢,上升到最高點后呈整體下降趨勢;蘋果酸在第0～6 d呈先下降后上升趨勢,6 d之后變化起伏較大;檸檬酸在第0～4 d呈下降趨勢,4 d后呈上升趨勢;丙酸在第0～7 d呈先下降后上升趨勢,7 d之后基本保持在一定水平。從各有機酸的含量變化情況可以看出泡菜在第7 d左右發酵基本完成,泡菜可以食用。

2.7 泡菜樣品中酸度及pH的測定結果

泡菜樣品在發酵過程中酸度及pH的測定結果見表6。

表6 泡菜樣品在發酵過程中酸度及pH的測定結果Table 6 Contents of total acidity and pH in kimchi during fermentation

由表6可知,泡菜酸度隨著發酵時間的延長總體呈上升趨勢,在最初3 d,泡菜酸度變化不大,第3～9 d上升較快,之后趨于穩定,這與閆雅嵐等[21]的泡菜在自然發酵過程中營養成分變化規律的研究結果相似;pH隨著發酵時間的延長總體呈下降趨勢,第1 d變化較小,第1～7 d下降顯著,第7 d后變化趨緩,這與楊瑞等[22]的泡菜發酵過程中主要化學成份變化規律的研究結果基本相似。

3 結論

本實驗采用高效液相色譜法對甘藍泡菜發酵過程中的有機酸成分進行快速定性定量分析,結果表明,隨著發酵時間的延長,有機酸的種類及含量都在發生著變化:草酸含量一直最高,乳酸次之;從各有機酸的含量變化情況可看出泡菜在第7 d左右發酵基本完成,即可食用。該方法具有操作簡單、快速、準確度高、精密度好的特點,適用于泡菜發酵過程中有機酸快速定性及其含量的測定。

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