嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌雙重?zé)晒釶CR快速檢測方法的建立

黃建飛,劉小青,劉 斌,陳澤峰,蘭全學(xué),陳 晶

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院,食品檢測所，廣東深圳 518131)

阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)是一種革蘭氏陰性、依靠周生鞭毛運動、無芽孢兼性厭氧菌[1],曾用名為產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌(Enterobacteraloacae),1980年更名為阪崎腸桿菌[2],2008年Iversen等[3]將阪崎腸桿菌定義為腸桿菌的一個新屬克羅諾桿菌屬(Cronobactergen.nov)。該菌可導(dǎo)致新生嬰兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥。雖然發(fā)病率較低,但感染該菌的新生兒病死亡率高達(dá)40%～80%[4]。嬰幼兒食品中由阪崎腸桿菌污染所引起的嬰兒感染已經(jīng)引起全球的廣泛關(guān)注,阪崎腸桿菌具有較強的繁殖能力,嬰兒配方食品中極微量的污染(<3 CFU/100 g)就可能大量繁殖[5]。因此需要建立嬰幼兒食品中阪崎腸桿菌的快速、靈敏和特異的檢測方法。

目前,食品中阪崎腸桿菌的檢測方法主要采用食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.402010 《食品微生物學(xué)檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》,該方法以生化鑒定為主,檢測周期長,而且檢測結(jié)果受檢測人員的主觀因素影響,特異性和靈敏度均不高。PCR技術(shù)為阪崎腸桿菌的檢測提供了一種快速的方法,出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T18702016《出口食品中食源性致病菌檢測方法實時熒光PCR法》和SN/T 1632.3-2013《出口奶粉中阪崎腸肝菌(克羅諾桿菌屬)檢驗方法 熒光PCR方法》規(guī)定了阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)的單重?zé)晒釶CR檢測方法。單重?zé)晒釶CR檢測方法容易產(chǎn)生假陽性和假陰性問題,特異性多重?zé)晒釶CR檢測體系可以大大降低假陽性和假陰性機率。孟雙等[6]采用阪崎腸桿菌的16S rRNA與23S rRNA之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)以及ompA基因作為檢測的靶標(biāo),建立了阪崎腸桿菌高靈敏、高特異的實時熒光雙重PCR快速檢測體系。Hu等[7]采用cgcA和內(nèi)參基因建立雙重?zé)晒釶CR體系檢測阪崎腸桿菌。王金鳳等[8]以阪崎腸桿菌ompA為靶基因,以BHK21細(xì)胞的Nmi基因為擴增內(nèi)標(biāo),建立阪崎腸桿菌實時熒光PCR快速檢測體系。Kaclikova等[9]采用阪崎腸桿菌基因MMS、Mfla1165和內(nèi)參pUC19 DNA建立三重?zé)晒釶CR檢測體系。

目前國內(nèi)外針對阪崎腸桿菌的熒光PCR檢測方法常見的靶基因主要有16S rRNA[10]、ITS序列[11]、ompA基因[12]、MMS基因[13]、cgcA[7]和ropB[14]等。本研究采用雙重?zé)晒釶CR體系,同時擴增阪崎腸桿菌的MMS和ompA基因,建立阪崎腸桿菌高靈敏、高特異性的實時雙重?zé)晒釶CR快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

15株阪崎腸桿菌和24株非阪崎腸桿菌作為參照菌株見表1,所有菌株采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng);實驗中所用引物見表2,引物和探針序列 均由上海生工技術(shù)公司合成;培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯、緩沖蛋白胨水(BPW) 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Premix ExTaq聚合酶 Takara公司;嬰幼兒奶粉 市售。

表1 實驗菌株及特異性結(jié)果Table 1 Bacterial species used and RTPCR analysis

表2 實驗中常用引物Table 2 Primers used in this study

Agilent Mx3005P熒光PCR儀 Agilent公司;330K離心機 德國Sigma公司;SHP250生化培養(yǎng)箱 上海精宏。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用水煮法提取細(xì)菌全基因組DNA。取過夜培養(yǎng)的營養(yǎng)肉湯菌液1.5 mL于無菌EP管中,13000 r/min常溫下離心30 s,棄去上清,將菌體懸浮于200 μL無菌水中,100 ℃水浴加熱15 min,13000 r/min常溫下離心30 s,取上清即可作為模板[15]。

1.2.2 雙重?zé)晒釶CR體系的建立 對MMS和ompA引物濃度和探針濃度采用L16(44)正交優(yōu)化(重復(fù)三次實驗),各因素水平參照Hyeon等[16]和Ward等[17]多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系并做出微小調(diào)整,各因素的四水平采用1、2、3和4進(jìn)行編碼,如表3,其中2×Premix Ex Taq 12.5 μL,DNA模板1 μL,加無菌水至25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性20 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共40個循環(huán),擴增曲線Ct>35為陰性結(jié)果。

表3 正交實驗因素和水平Table 3 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.3 雙重?zé)晒釶CR體系特異性分析 用水煮法提取39株菌的基因組DNA并以此為模板分別進(jìn)行雙重?zé)晒釶CR擴增,觀察雙重?zé)晒釶CR體系的擴增效果,分析雙重?zé)晒釶CR體系檢測阪崎腸桿菌的特異性。

1.2.4 靈敏度實驗 將過夜培養(yǎng)的阪崎腸桿菌(ATCC 29544)培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-8),取每個稀釋的梯度分別進(jìn)行平板計數(shù)和煮沸法提取基因組DNA,采用雙重?zé)晒釶CR體系進(jìn)行阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度檢測。

1.2.5 抗干擾能力 取1 mL不同濃度的阪崎腸桿菌菌液(10倍梯度稀釋)分別和1 mL混合菌(24株非阪崎腸桿菌)等體積混合,直接煮沸法提取基因組DNA作為模板進(jìn)行雙重?zé)晒釶CR,觀察該體系的抗干擾能力,同時對不同稀釋梯度的阪崎腸桿菌菌液進(jìn)行平板計數(shù)。

1.2.6 人工污染奶粉的檢測 將過夜培養(yǎng)的阪崎腸桿菌進(jìn)行10倍稀釋,取1 mL 10-5～10-8四個梯度加入到100 g奶粉中,同時進(jìn)行平板計數(shù)。將上述人工污染的100 g奶粉加入到900 mL BPW培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h進(jìn)行增菌,取1 mL增菌液收集菌體后采用水煮法提取DNA作為模板進(jìn)行雙重?zé)晒釶CR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重?zé)晒釶CR體系建立

L16(44)正交實驗結(jié)果見表4,從表中可以看出,各因素水平主要影響MMS擴增效果,擴增曲線最優(yōu)條件為MMS引物濃度0.6 μmol/L,探針濃度0.2 μmol/L,ompA引物濃度0.2 μmol/L,探針濃度0.2 μmol/L,對應(yīng)ompA和MMS曲線的Ct值分別為18.51和19.23。

表4 正交實驗結(jié)果 Table 4 Results of orthogonal tests

2.2 雙重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系特異性

根據(jù)雙重?zé)晒釶CR體系對15株阪崎腸桿菌和24株非阪崎腸桿菌進(jìn)行特異性分析,結(jié)果顯示15株阪崎腸桿菌的ompA和MMS基因都出現(xiàn)典型的擴增曲線,24株非阪崎腸桿菌ompA和MMS基因都無擴增曲線,結(jié)果見表1,說明本研究建立的體系對阪崎腸桿菌檢測具有較高的特異性。

2.3 靈敏度

雙重?zé)晒釶CR體系靈敏度檢測結(jié)果見圖1,當(dāng)阪崎腸桿菌濃度為4.3×103CFU/mL時，ompA和MMS擴增曲線的Ct<35,當(dāng)阪崎腸桿菌濃度為4.3×102CFU/mL時ompA和MMS擴增曲線的Ct>35,結(jié)果為陰性,該雙重?zé)晒釶CR體系下阪崎腸桿菌的靈敏度為4.3×103CFU/mL。

圖1 雙重?zé)晒釶CR檢測阪崎腸桿菌的靈敏度Fig.1 Sensitivity of Enterobacter sakazakii by duplex realtime PCR注:1～6對應(yīng)的阪崎腸桿菌濃度為4.3×108～4.3×103 CFU/mL,圖中未標(biāo)出Ct>35的陰性結(jié)果,●代表基因MMS擴增曲線,△代表基因ompA擴增曲線。

2.4 抗干擾能力

人工接種混合菌進(jìn)行抗干擾實驗結(jié)果見圖2,結(jié)果表明在108CFU/mL其他混合菌存在的條件下,該PCR反應(yīng)體系對阪崎腸桿菌的檢出限為103CFU/mL,靈敏度未受顯著影響。

圖2 雙重?zé)晒釶CR檢測阪崎腸桿菌的抗干擾能力Fig.2 Detection of Enterobacter sakazakii in the presence of mixed bacteriaby duplex realtime PCR注:在其他混合菌濃度為108 CFU/mL下,1～5對應(yīng)的阪崎腸桿菌濃度為107～103 CFU/mL,●代表基因MMS擴增曲線,△代表基因ompA擴增曲線。

2.5 人工污染奶粉的檢測

取100 g經(jīng)驗證后無阪崎腸桿菌污染的奶粉,溶于900 mL BPW中,每個瓶中分別加入1 mL含2×103、2×102、20和2 CFU/mL阪崎腸桿菌。結(jié)果見圖3，由圖3可知人工污染的奶粉都有典型的擴增曲線,能成功檢測出阪崎腸桿菌,而陰性未接菌樣品擴增后則沒有擴增曲線,奶粉中阪崎腸桿菌的檢出限為2 CFU/100 g。

圖3 雙重?zé)晒釶CR檢測奶粉中阪崎腸桿菌的靈敏度Fig.3 Sensitivity of realtime PCR for Enterobacter sakazakii detection in infant formula注:1～4對應(yīng)的奶粉中阪崎腸桿菌濃度為2×103～2 CFU/100 g,●代表基因MMS擴增曲線,△代表基因ompA擴增曲線。

3 討論

外膜蛋白A是阪崎腸桿菌的主要毒力因子,在其致病過程中發(fā)揮了重要作用。Singamsetty等[18]人研究發(fā)現(xiàn)未攜帶外膜蛋白A的阪崎腸桿菌對宿主細(xì)胞的侵入力和黏附作用比正常菌株低7倍。Dong等[19]人通過ompA建立單重?zé)晒釶CR體系進(jìn)行阪崎腸桿菌檢測,該體系特異性強,靈敏度為2.8×102CFU/mL。人工污染奶粉經(jīng)過24 h增菌檢出限為1.1 CFU/mL。局部大分子合成操縱子序列是一段比較保守序列,可用于阪崎腸桿菌檢測,Wang等[20]人通過MMS序列建立熒光PCR體系進(jìn)行阪崎腸桿菌檢測,該體系靈敏度為1.2×103CFU/mL。人工污染奶粉經(jīng)過24 h增菌檢出限為100CFU/100 g。本實驗針對ompA和MMS基因建立的雙重?zé)晒釶CR檢測體系對阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度為4.3×103CFU/mL,抗干擾能力優(yōu)異,在高濃度混合菌(108CFU/mL)的存在下阪崎腸桿菌的檢出限仍為103CFU/mL,靈敏度未受顯著影響。人工污染奶粉樣品的模擬實驗顯示,增菌后雙重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系可以檢測阪崎腸桿菌濃度為2 CFU/100 g。

4 結(jié)論

本研究建立了食品中阪崎腸桿菌的雙重?zé)晒釶CR體系,具有靈敏高、特異性和抗干擾能力強特點,經(jīng)24 h增菌后能夠檢測出奶粉中較低含量的阪崎腸桿菌,為日常食品樣品中阪崎腸桿菌快速檢測提供有效分析手段。

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