東北地區不同蘋果果實的類黃酮組分及含量分析

劉暢，趙繼榮，王昆，于文全，顧廣軍，卜海東，冷長龍，葉萬軍

(1.黑龍江省農業科學院牡丹江分院,黑龍江省寒地果樹重點試驗室，黑龍江 牡丹江 157000；2.延安大學生命科學學院, 陜西省紅棗重點實驗室, 陜西 延安 716000； 3.中國農業科學院果樹研究所，遼寧 興城 125100；4.牡丹江市東和林場，黑龍江 牡丹江 157041；5.黑龍江省農業科學院園藝分院，哈爾濱 150030)

蘋果是世界四大水果之一，在我國栽種和生產面積均居世界首位[1]。蘋果含有豐富的類黃酮物質，類黃酮是一種重要的酚類代謝產物，包括花色素苷類、黃酮醇類和黃烷醇類等五大類[2]，在植物中廣泛存在，對生物合成起著非常重要的作用[3-4]。類黃酮因具有抗氧化性[5]，抗逆性[6]，抗病毒[7-8]等作用，同時還具有較強的自由基清除能力，影響果實加工風味[9]，近些年越來越受到學者關注，選育高類黃酮蘋果品種也成了蘋果育種者的育種方向之一[10-11]。

黑龍江省屬于東北寒地中小蘋果栽培區，由于秋季晝夜溫差大，蘋果風味獨特，口感極佳[12]。目前關于蘋果類黃酮的研究大多集中在蘋果主產區，對東北寒地小蘋果的果實類黃酮組分研究學者較少。本研究以龍帥、雞心果、齊早紅、龍紅、紫香和龍秋6個蘋果為試材通過高效液相色譜法進行果實類黃酮組分及含量分析，為了解寒地小蘋果果實類黃酮組分特性及高類黃酮功能性蘋果品種選育、開發利用提供理論基礎和數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗蘋果資源均采自黑龍江省農業科學院牡丹江分院果樹資源圃，選取龍帥、龍紅、龍秋等6個蘋果品種(見表1)，每個品種選擇樹勢一致，生長健壯的果樹。在每株樹冠外圍東西南北4個方向同一高度隨機采集20個成熟果實，果實成熟標準參照王大江[13]的方法。將果實迅速送到中國農業科學院果樹所國家重點實驗室進行液氮保存，準備待測。

表1 6個供試東北蘋果品種

1.2 試驗試劑與方法

1.2.1 試驗試劑。甲酸、乙腈、甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)，其他試劑均為國產分析純。原花青素B1、原花青素B2、原花青素B4、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲-半乳糖苷、槲-葡苷、槲皮苷、矢-3-0-半乳糖苷、矢-3-0-葡萄糖苷、花色素鼠李糖苷(標準品，純度≥98%，中國成都曼斯特公司)。

1.2.2 試驗方法。樣品處理及類黃酮組分含量測定參考聶繼云等[14]方法略有改動。稱取冷凍研磨后的蘋果皮混合樣2.0 g，加入使用80%乙醇5.0 mL，搖勻后放置在超聲波中超聲20 min后，10000 r/min離心機中的離心5 min，上清液轉移到10.0 mL離心管中，使用5.0 mL 80%乙醇重復提取1次，上清液轉移到10.0 mL離心管中，合并2次提取上清液，定容到10 mL，吸取5 mL提取液在40 ℃旋轉蒸發儀上蒸發出去乙醇，剩余2 mL水相分兩次過Oasis?HLB固相萃取小柱(固相萃取小柱首先用5 mL甲醇和5 mL純凈水活化，將樣品提取液倒入活化好的固相萃取小柱上，用5 mL甲醇次淋洗固相萃取小柱，棄去廢液，再用5 mL去離子水淋洗固相萃取小柱，棄去廢液)，用5 mL甲醇分2次淋洗小柱，收集濾液，40 ℃旋轉蒸發儀上蒸發收集的濾液至近干，甲醇定容5 mL，過0.22 μm有機相濾膜，待測。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2017進行計算和整理，采用SPSS 22.0進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同蘋果品種類黃酮各組分比例差異分析

圖1 不同蘋果品種果實類黃酮各組分比例

6個蘋果品種只有龍秋含有12種類黃酮組分，通過圖1可以看出所有品種中有4種組分所占比例最大，表兒茶素，所占比例變化范圍為10.65%～59.09%，其中比例最低的品種為龍紅，比例最高的品種為齊早紅；槲-半乳糖苷，所占比例變化范圍為3.87%～37.96%；其中比例最低的品種為龍秋，比例最高的品種為龍紅；槲-葡苷，所占比例變化范圍為5.98%～14.62%，其中比例最低的品種為齊早紅，比例最高的品種為紫香；槲皮苷，所占比例變化范圍為11.49%～27.61%，其中比例最低的品種為齊早紅，比例最高的品種為紫香。12種類黃酮組分因品種不同，所占比例表現出較大差異。

2.2 不同蘋果品種間類黃酮含量主成分分析

將6個品種的槲-半乳糖苷、槲皮苷、花色素鼠李糖苷等12個指標進行主成分分析，提取前3個主成分。由表2可知，第一成分的特征值5.226，方差貢獻率43.551%，為第一主成分。第二、三主成分的貢獻率分別是27.129%、16.449%。前3個主成分特征值大于1,累計貢獻率達到88.804%，因此選這3個主成分作為綜合評價指標。

表2 不同蘋果品種果實類黃酮含量主成分分析

通過方差旋轉得到12個因子之間相關性大小，結果見表3。第一主成分中原花青素B1，原花青素B2，槲-半乳糖苷，槲-葡苷，槲皮苷和蘆丁對主成分產生正向影響，原花青素B1含量特征向量值最大為0.970，原花青素B2含量特征向量值為0.915，居第二位。因此，第一主成分主要與黃烷醇有關；第二主成分中花色素鼠李糖苷、原花青素B4和兒茶素對主成分產生正向影響，花色素鼠李糖苷含量特征向量值最大為0.895。第二主成分主要與花色苷有關；第三主成分中矢-3葡萄糖苷和表兒茶素對主成分產生正向影響且矢-3葡萄糖苷含量特征向量值最大為0.843，主要與花色苷有關，補充第二主成分。說明黃烷醇類物質在類黃酮當中起重要作用。

表3 不同蘋果品種果實3個主成分特征向量

2.3 不同蘋果品種間類黃酮含量相關性分析

通過對不同蘋果品種間類黃酮組分含量進行相關性分析，發現類黃酮各組分之間存在顯著相關性，結果見表4。其中槲-半乳糖苷和槲皮苷呈顯著正相關，說明槲皮苷含量隨槲-半乳糖苷含量增加而增加。兒茶素和矢-3-0-半乳糖苷、原花青素B4和花色素鼠李糖苷、表兒茶素和矢-3-0-葡萄糖苷含量均呈正相關，說明黃烷醇與花色苷關系密切。原花青素B1與原花青素B2、蘆丁、槲-葡苷含量呈正相關，說明黃烷醇與黃酮醇關系密切。進一步證明黃烷醇在類黃酮組分中起主要作用，與表3結果一致。

表4 不同蘋果品種果實類黃酮含量相關性分析

3 討論與結論

用HPLC方法進行果樹果實類黃酮檢測不但高效而且可靠[15-16]。本研究對供試的6個東北小蘋果品種進行檢測發現類黃酮總含量分別是龍帥(105.49 mg/kg)、雞心果(66.97 mg/kg)、齊早紅(124.84 mg/kg)、龍紅(232.83 mg/kg)、紫香(91.84 mg/kg)和龍秋(169.36 mg/kg)，進一步分析發現龍帥以表兒茶素為主(32.78 mg/kg)，雞心果以槲皮苷為主(14.13 mg/kg)，齊早紅以表兒茶素為主(73.77 mg/kg)，龍紅以槲-半乳糖苷為主(88.38 mg/kg)，紫香以槲皮苷為主(25.36 mg/kg)，龍秋以兒茶素為主(37.93 mg/kg)，通過對不同蘋果品種類黃酮組分進行測定并對含量進行分析，發現各組分含量存在明顯差異。

類黃酮是果實重要功能性成分[17]，關于蘋果類黃酮的組分及含量分析之前有學者對其進行研究，發現果實類黃酮在果皮和果肉中因品種不同而有明顯差異。聶繼云等[18]對不同產地的‘長富2號’蘋果檢測分析發現果皮中有16種類黃酮。本研究發現6個供試材料含量共檢測到12種類黃酮，只有龍紅檢測到全部組分，根皮苷由于含量很少沒有計算在內。表兒茶素含量范圍為10.20～73.77 mg/kg、槲-半乳糖苷含量范圍為5.36～88.38 mg/kg、槲皮苷含量范圍為11.82～49.64 mg/kg，三者占類黃酮總含量57.48%。與聶繼云等學者研究結果不一致，分析可能是由于地理因素和生長環境不同和大蘋果相比類黃酮種類含量少，但還需要增加品種進行驗證。崔志杰等[19]學者研究發現兒茶素和表兒茶素具有抗病毒等多種功能，乜蘭春等[20]研究發現果實果皮兒茶素和表兒茶素高于果肉，且含量越高，果實風味越澀。本研究發現6個品種兒茶素和表兒茶素差異明顯，齊早紅表兒茶素(73.77 mg/kg)和龍秋兒茶素(37.93 mg/kg)含量均較高，對功能性蘋果開發利用潛力很大。

研究進一步采用了主成分分析法和相關性分析法對6種蘋果果實類黃酮成分進行分析。目前，這兩種方法在不同蘋果品種果實營養價值的評價[21]以及蘋果種質資源評價中得到廣泛的應用[22]。Vrhovsek等[23]對金冠等不同蘋果測定發現，黃烷醇含量最高，并且同一類黃酮中的各種組分含量存在明顯差異。本研究通過主成分分析把蘋果類黃酮12個組分簡化為3個主成分因子，且方差貢獻率累計達88.80%，其中黃烷醇類物質含量最高，與前人研究結果一致。

綜上所述，6個供試東北小蘋果品種檢測到黃酮醇，黃烷醇，花色苷3類12種，在類黃酮組成及含量上具有豐富多樣性。為類黃酮組分提取及保健食品開發提供原料，為東北小蘋果高類黃酮品種的選育提供理論基礎。