一株源自深海沉積物產中溫α-淀粉酶菌株的鑒定及其酶學性質的研究

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(1.揚州大學環境科學與工程學院,海洋科學技術研究所,江蘇揚州 225100; 2.河北農業大學植物保護學院,河北保定 071001)

α-淀粉酶是能夠隨機切割α-1,4-糖苷鍵降解淀粉和其他碳水化合物的內切酶類。α-淀粉酶占據了工業酶制劑市場的25%～30%,在淀粉加工、釀造、酒精生產、紡織和其他工業領域具有廣泛的應用[1]。傳統的淀粉糖化生物工藝通常涉及液化和糖化兩個過程。研究發現,這兩個過程均在高溫下進行:液化所需的溫度為80～90 ℃,而糖化所需的溫度為55～60 ℃[2]。嗜熱α-淀粉酶在節約成本、溶解底物、降低粘度和減少微生物污染風險方面具有明顯的優勢。極端嗜熱菌的最適生長溫度高于80 ℃,是產生嗜熱α-淀粉酶的重要來源[3],從而引起了國內外研究者的關注。因此,嗜熱α-淀粉酶在淀粉糖化生物工藝方面具有潛在的應用價值。發掘具有新型功能的α-淀粉酶,特別是嗜熱性強的α-淀粉酶,對于科學研究以及工業應用都具有重大的研究意義。而由于極端嗜熱α-淀粉酶的最佳活性溫度超出了工業需求的溫度,所以中度嗜熱α-淀粉酶比極端嗜熱α-淀粉酶在工業方面具有更大的應用價值。例如,最適溫度在50～65 ℃的α-淀粉酶能夠有效地減少副產品的形成和降低能源需求,在淀粉液化方面比極端嗜熱α-淀粉酶更具有潛在優勢。

大多數α-淀粉酶來源于陸地微生物的芽孢桿菌屬,但是從海洋環境中獲得的α-淀粉酶具有獨特的性質,受到越來越多的關注。與陸地環境相比,海洋環境具有高壓、低溫或高溫(熱液口)、高鹽、寡營養等典型的環境特征,蘊藏著豐富、性質獨特的海洋微生物。深海微生物由于具有獨特的代謝途徑,從而成為提供新型極端酶的重要資源庫。目前,已有一些源自深海細菌α-淀粉酶的報道:Bacillussp. SCSIO 15121[4-5],Nocardiopsissp. 7326[6],Geobacillussp. 4j[7],Flammeovirgapacifica[8],LuteimonasabyssiXH031[9],Thermotogamaritima[10]和Rhodothermusmarinus[11]。此外,幾種源自深海極端嗜熱古菌火球菌屬和熱球菌屬的嗜熱α-淀粉酶也已經被研究[2,12]。這些源自海洋環境微生物的α-淀粉酶在熱穩定性、耐鹽性和pH穩定性等方面具有特殊的性質,不同于源自陸地微生物的α-淀粉酶。最近,Homaei等人綜述了源自海洋微生物的淀粉酶[13];Hiteshi和Gupta探討了α-淀粉酶的熱適應性機制[14]。

本文從西南印度洋洋中脊非活動熱液區的深海沉積物中分離出一株能夠有效地降解淀粉的菌株,研究其生長的最適溫度和最適pH,并對其所產生的α-淀粉酶的酶學性質進行了初步研究,為淀粉糖化過程中進行淀粉的降解提供了深海微生物資源。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

深海沉積物樣本編號為DY11-15-20 TVG11,是由大洋一號于2009年1月巡航期間,在西南印度洋洋中脊通過電視捕獲取樣器在1985 m水深處收集得到;蛋白胨及酵母提取物分析純,英國OXOID公司;基因組提取試劑盒美國Omega Bio-tek公司;2×Taq PCR MasterMix美國New England Biolab公司;淀粉分析純,美國Sigma公司;Tris、甘氨酸分析純,美國AMRESCO公司;氯化鈉、氯化鉀、瓊脂粉、碘、碘化鉀、醋酸、磷酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、戊二醛、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、乙醇、3,5-二硝基水楊酸、苯酚分析純,中國國藥集團;稀釋LB 培養基蛋白胨1.0 g,酵母提取物0.5 g,氯化鈉1.0 g,并加入人工海鹽將鹽度調到35‰;完全溶解后,1×105Pa濕熱滅菌20 min。

THZ-92 C恒溫振蕩器上海博迅實業有限公司;SHP-160型生化培養箱上海三發科學儀器有限公司;722可見紫外分光光度計上海菁華科技儀器有限公司;S-4800電子顯微鏡日本日立公司;C1000 Touch PCR 儀美國Bio-Rad公司;Heraeus Pico17微型臺式離心機美國Thermo Fisher 公司;FE20pH計梅特勒-托利多儀器(上海)公司;CT15RE臺式微量高速離心機日本HITACHI公司。

1.2　實驗方法

1.2.1淀粉降解菌的篩選稱取0.5 g深海沉積物樣本,接種到20 mL稀釋LB液體培養基中,28 ℃、180 r/min培養24 h。取新鮮培養物,劃線接種于稀釋LB 固體培養基,倒置于恒溫培養箱中培養。挑取生長較好的單菌落,進一步劃線分離純化3～4次。將多次劃線分離得到的單菌落,接種于稀釋LB培養基,28 ℃、180 r/min培養24 h。分別取2 μL培養物接種在含有1%可溶性淀粉的稀釋LB培養基平板上,過夜培養。碘液染色5 min,輕輕倒去碘液,菌落周圍形成透明圈的菌株即為能夠降解淀粉的菌株。選取形成透明圈最大的菌株,命名為TVG11-1,進行后續的研究。

1.2.2菌株TVG11-1的形態鑒定將菌株TVG11-1接種到35‰鹽度的稀釋LB液體培養基中,在最適溫度45 ℃振蕩培養至OD600為0.5～0.6。取1 mL菌液至無菌1.5 mL離心管,8000 r/min離心5 min,去上清。取無菌去離子水重懸洗滌細胞,重復兩次,使用2.5%戊二醛在4 ℃溫度下固定樣品2 h。取1 mL 0.1 mol/L PBS緩沖液重懸洗滌細胞,重復三次,分別使用30%、50%、70%、80%、90%及100%乙醇對樣品進行梯度脫水,每個梯度加入乙醇后靜置10 min。經過臨界點干燥和噴金處理后,通過掃描電鏡對菌株TVG11-1的形態學特征包括細胞形態,大小和表面紋理進行分析。

1.2.3菌株TVG11-1最適生長溫度和pH的確定將過夜活化的菌株TVG11-1按1%接種量接種到35‰鹽度的稀釋LB液體培養基中。選擇30～80 ℃溫度范圍,振蕩培養6 h。通過測定不同溫度條件下菌株TVG11-1培養物在600 nm處吸光度值,以確定其最適生長溫度。

選擇不同緩沖體系(濃度20 mmol/L):pH5.0和pH5.5(醋酸-乙酸鈉體系),pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5(磷酸鈉-氫氧化鈉體系),pH8.0和pH8.5(Tris-鹽酸體系),pH9.0和pH9.5(甘氨酸-氫氧化鈉體系),對生長培養基的pH進行調整。45 ℃振蕩培養6 h,通過測定不同pH條件下菌株TVG11-1培養物在600 nm處吸光度值,以確定其最適生長pH。

1.2.4菌株TVG11-1的分子生物學鑒定在最適溫度45 ℃和pH7.0條件下,培養菌株TVG11-1 18 h。取2 mL過夜培養物,利用OMEGA基因組提取試劑盒提取菌株TVG11-1的基因組DNA。以菌株TVG11-1的基因組DNA為模板,以gyrB-F(5′-TTG RCG GHR GYG GHT ATA AAG T-3′)和gyrB-R(5′-TCC DCC STC AGA RTC WCC CTC-3′)為引物,進行gyrB基因的PCR擴增[15]。PCR反應體系為25 μL:12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix,0.2 μmol/L的正向引物和反向引物,10 ng基因組DNA。PCR程序為:95 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s 共35個循環,72 ℃ 5 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,并且由生工生物技術有限公司(中國上海)進行測序。

通過BLAST,檢索GenBank數據庫中與菌株TVG11-1的gyrB基因序列相似的序列。選取具有95%相似性的序列,構建系統發育樹。利用CLUSTAL X 2.0對相似性最近的芽孢桿菌屬序列進行多重比對[16]。以相似性低、部分注釋的芽孢桿菌gyrB基因序列作為外群。采用鄰接法和最大似然法構建系統發育樹[17],bootstrap設為1000次。

1.2.5粗酶液制備和酶活分析取不同條件下菌株TVG11-1的培養物,進行冷凍離心(4 ℃,10000 r/min,20 min),取上清液作為粗酶液。

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[18],測定淀粉水解過程中還原糖的產量,從而進行α-淀粉酶活力的分析。反應體系為2 mL:1.5 mL 1.0%的可溶性淀粉和0.5 mL的粗酶液。在不同條件下進行反應,加入2 mL DNS,終止反應,混勻后100 ℃下加熱10 min。反應物冷卻至室溫后測定540 nm處的OD值。α-淀粉酶的活力單位定義為每分鐘產生1 μmol還原糖的酶量。實驗重復三次,取平均值,并計算標準差。

1.2.6菌株TVG11-1的生長溫度對α-淀粉酶產量的影響將過夜活化后的菌株TVG11-1按1%的比例接種到pH7.0,鹽度為35‰的稀釋LB液體培養基,在不同溫度下(25、30、40、45、50、55、60 ℃)過夜培養18 h。按照上述方法制備粗酶液,測定α-淀粉酶活性,從而分析菌株TVG11-1的生長溫度對α-淀粉酶產量的影響。

1.2.7淀粉含量對于菌株TVG11-1α-淀粉酶產量的影響將過夜活化菌株TVG11-1,分別接種到含有不同可溶性淀粉含量(0.2%～1.0%)并且鹽度為35‰的稀釋LB液體培養基中,在最適溫度和pH的條件下過夜培養18 h。按照上述方法制備粗酶液,測定α-淀粉酶活性,計算相對酶活,從而確定淀粉含量對菌株TVG11-1α-淀粉酶產量的影響。相對酶活計算公式,如式(1):

相對酶活力(%)=不同淀粉濃度實驗組測得OD540值/不含淀粉實驗組測得OD540值×100

式(1)

1.2.8菌株TVG11-1的生長周期與α-淀粉酶產量關系將過夜活化后的菌株TVG11-1在最適溫度和pH的條件下,按1%的比例接種到pH7.0,鹽度為35‰的LB稀釋液體培養基振蕩培養。通過測定菌株TVG11-1培養物在不同時間(2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0、13.0、14.5 h)的OD600值,繪制其生長曲線。每次取樣測定菌液OD600時,按照上述方法制備粗酶液,測定α-淀粉酶活性,從而確定菌株TVG11-1的生長周期與α-淀粉酶產量的關系。

1.2.9反應溫度對菌株TVG11-1α-淀粉酶活性的影響將菌株TVG11-1在最適溫度和pH的條件下,過夜培養18 h。按照上述方法制備粗酶液,測定在pH7.0時,菌株TVG11-1α-淀粉酶在35～85 ℃的酶活,從而確定該酶的最適反應溫度。使用以下緩沖液(終濃度為20 mmol/L)調整反應的pH:pH5.0和pH5.5(醋酸-乙酸鈉體系),pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5(磷酸鈉-氫氧化鈉體系),pH8.0和pH8.5(Tris-鹽酸體系),pH9.0和pH9.5(甘氨酸-氫氧化鈉體系),然后進行菌株TVG11-1α-淀粉酶酶活力分析,計算相對酶活,從而確定該酶酶活的最適pH。相對酶活計算公式,如式(2):

式(2)

1.2.10反應pH對菌株TVG11-1α-淀粉酶活性的影響將菌株TVG11-1在最適溫度和pH的條件下,過夜培養18 h。按照上述方法制備粗酶液,測定在最適溫度下,菌株TVG11-1α-淀粉酶在pH在5.0～9.5條件下酶活,從而確定該酶的最適反應pH。使用以下緩沖液(終濃度為20 mmol/L)調整反應的pH:pH5.0和pH5.5(醋酸-乙酸鈉體系),pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5(磷酸鈉-氫氧化鈉體系),pH8.0和pH8.5(Tris-鹽酸體系),pH9.0和pH9.5(甘氨酸-氫氧化鈉體系)。相對酶活計算同式(2)。

1.3　數據處理

采用Excel處理數據,計算平均值和標準差;利用CLUSTAL X 2.0軟件進行序列多重比對,并用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

2　結果與分析

2.1　菌株TVG11-1的特征

通過劃線分離獲得多株可降解淀粉的菌株,其中TVG11-1菌落生長最快,菌落最大。菌株TVG11-1革蘭氏染色呈陽性,在電子顯微鏡觀察下呈桿狀(圖1A)。對含有淀粉的瓊脂培養基上過夜培養的TVG11-1菌落,使用革蘭氏碘溶液染色后,能夠觀察到明顯的透明圈(圖1B),表明菌株TVG11-1能夠產生水解淀粉的α-淀粉酶。進一步的研究發現,菌株TVG11-1的最適生長溫度為45 ℃(圖2A),最適生長pH為7.0(圖2B)。菌株TVG11-1已保存在中國農業菌種保藏中心(編號ACCC19897)。

圖1　菌株TVG11-1的電鏡照片(A)及其在含有淀粉的平板上形成的透明圈(B)Fig.1　Scanning electron micrograph of the strain TVG11-1(A)and its clear zone in starch agar-iodine plate(B)

圖3　菌株TVG11-1與相關菌株的系統發育樹Fig.3　Phylogenetic tree of the strain TVG11-1 and its relatives注:括號內為GenBank登錄號;線段0.05表示序列差異的分支長度;發育樹節點的數值表示Bootstrap值。

根據上海生工分析測序結果,菌株TVG11-1包含了894個核苷酸的gyrB基因序列,已被遞交至GenBank數據庫,登錄號為KX265578。用BLAST程序,對菌株TVG11-1的gyrB基因序列與GenBank 數據庫中已收錄的其他相似序列進行核酸序列同源性比較。選取了17個具有代表性的gyrB基因序列用于構建系統發育樹,其中10條序列與KX265578的相似度在98%以上,其余7條序列與KX265578同源性在90%。所構建的系統發育樹(圖3)表明,在這18個gyrB基因序列組成的系統發育樹中,菌株TVG11-1(KX265578)與解淀粉酶芽孢桿菌聚在一個分支,該分支的支持率為100%,因此本文將菌株TVG11-1確定為解淀粉酶芽孢桿菌。關于解淀粉酶芽孢桿菌的產α-淀粉酶條件已有相關研究[19-22];也有利用分子技術對來自該菌α-淀粉酶進行分離,進一步對其結構及性質的相關報道[23-26]。

圖2　菌株TVG11-1生長的最適溫度(A)及最適pH(B)Fig.2　The optimal temperature(A) and pH(B)of strain TVG11-1

2.2　不同溫度對TVG11-1 α-淀粉酶產量的影響

如圖4所示,隨著溫度的增加,菌株TVG11-1的OD600值和其α-淀粉酶的OD540值均呈現先增加后減少的趨勢,表明菌株的生長量與其α-淀粉酶的產量相吻合。在培養溫度為40 ℃時,菌株TVG11-1α-淀粉酶產量最高,而在該菌株最適生長溫度45 ℃時,其α-淀粉酶產量減少。由此可見,40 ℃是菌株TVG11-1產生α-淀粉酶的最適溫度,不同于該菌株的最適生長溫度(45 ℃)。

圖4　菌株TVG11-1的生長溫度對其α-淀粉酶產量的影響Fig.4　Effect of growth temperature of the strain TVG11-1 on α-amylase production

2.3　淀粉含量對菌株TVG11-1 α-淀粉酶產量的影響

如圖5所示,與不加可溶性淀粉的對照組相比,培養基中加入0.2%的可溶性淀粉時,菌株TVG11-1α-淀粉酶的產量最高,并隨著可溶性淀粉含量的增加,該酶的產量逐漸減少。當培養基中含有0.8%和1%可溶性淀粉時,菌株TVG11-1α-淀粉酶的產量要低于不加淀粉的對照組的產量。由此可見,菌株TVG11-1α-淀粉酶是一種不依賴于淀粉底物誘導的胞外酶。Konsula和Liakopoulou-Kyriakides研究了枯草芽孢桿菌產中溫α-淀粉酶,結果表明該酶也是不依賴淀粉底物誘導[21],與本研究的結果相一致。

圖5　淀粉含量對菌株TVG11-1 α-淀粉酶產量的影響Fig.5　Effect of soluble starch contents on the TVG11-1 α-amylase activity

2.4　菌株TVG11-1的生長周期與其α-淀粉酶活性的關系

為了分析菌株TVG11-1的生長周期與其α-淀粉酶活性的關系,測定不同培養時間內的培養物的OD600值和α-淀粉酶活性。如圖6所示,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性在培養時間為9 h時達到最大值(122.7 U/mL),而該菌株處于指數生長期。當菌株TVG11-1處于指數生長期后期,隨著生長時間的延長,菌株TVG11-1α-淀粉酶活性逐漸下降。由此,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性時間進程曲線與該菌株的生長曲線趨勢總體相符。

圖6　菌株TVG11-1的生長曲線與其α-淀粉酶活性的關系Fig.6　Relationship between growth curve of the strain TVG11-1 and its α-amylase activity

2.5　反應溫度對菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響

如圖7所示,菌株TVG11-1α-淀粉酶在35～85 ℃內均有活性。隨著溫度從35 ℃升高到60 ℃,菌株TVG11-1α-淀粉酶活性也隨之增加。然而,當溫度從60 ℃繼續升高至80 ℃時,該α-淀粉酶的活性呈下降趨勢。因此,60 ℃是菌株TVG11-1α-淀粉酶反應的最適溫度。

圖7　反應溫度對菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響Fig.7　Effect of reaction temperature on the TVG11-1 α-amylase

菌株TVG11-1α-淀粉酶活性的最適溫度(60 ℃)不同于該菌株的最適生長溫度(45 ℃)。與本研究結果相一致的相關研究已有很多報道,例如,Igarashi等人所分離出一株芽孢桿菌的最適生長溫度為30 ℃,但該菌株所產生的α-淀粉酶在55 ℃時具有最大的酶活性[27]。同樣,Sodhi等人發現芽孢桿菌PS-7的最適生長溫度(37 ℃)也不同于其α-淀粉酶的最適反應溫度(60 ℃)[28]。類似的結果還存在于枯草芽孢桿菌TN106(pAT 5)[29]和鏈霉菌IMD 267[30]。但是,有些芽孢桿菌的最適生長溫度與其α-淀粉酶的最適反應溫度相同[31-32]。因此,菌株的最適生長溫度與其產生的α-淀粉酶最適反應溫度是否相同,可能與菌株的生存環境相關。

2.6　反應pH對菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響

不同反應pH對TVG11-1菌株α-淀粉酶活性的影響,如圖8所示,菌株TVG11-1α-淀粉酶在pH5.5～9.0范圍內有活性,而當pH小于5.0時,該菌株α-淀粉酶無法降解淀粉。隨著pH的增加,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性呈現先增加后減少的趨勢。當反應pH為6.5時,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性最高,因此該酶的最適反應pH為6.5。這些結果表明,菌株TVG11-1α-淀粉酶在中性pH附近活性較高,在酸性條件下活性幾乎消失,但在偏堿性環境下仍具有40%以上相對酶活性。在最適條件下培養9 h,該酶平均酶活力為122.7 U/mL。

圖8　反應pH對菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響Fig.8　Effect of the reaction pH on the TVG11-1 α-amylase

與其他芽孢桿菌所產生的α-淀粉酶最適pH相比,菌株TVG11-1α-淀粉酶與已報道的枯草芽孢桿菌、深海芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌NH1所產生的α-淀粉酶的最適反應pH相同[21,33-34]。然而,芽孢桿菌GM8901和芽孢桿菌TS-23所產生的α-淀粉酶具有相同的最適反應溫度,但是它們的最適反應pH不同于菌株TVG11-1α-淀粉酶。芽孢桿菌種GM8901α-淀粉酶在pH11.0～12.0時表現出了最強活性[35],而芽孢桿菌種TS-23α-淀粉酶的最適pH為9[36]。另外,菌株TVG11-1α-淀粉酶與源自其它海洋微生物的α-淀粉酶具有相似的最適pH以及相同的最適溫度[37-39]。與上述研究結果不同的是,芽孢桿菌Bacillussp.Ferdowsicous的α-淀粉酶在pH低至4.5時,該酶仍具有最強的活性[40]。因此,源自不同環境的微生物所產生的α-淀粉酶在pH的適應性方面存在著差異性。

3　結論

本文首次從西南印度洋洋中脊非活動熱液區的深海沉積物中分離出一株能夠有效降解淀粉的菌株TVG11-1。通過電鏡和分子生物學鑒定,該菌株為解淀粉芽孢桿菌。菌株TVG11-1最適的生長溫度和pH分別為45 ℃和pH7.0,其所產生的α-淀粉酶是一種不依賴淀粉底物的胞外中溫淀粉酶,其最適反應溫度為60 ℃,最適反應pH為6.5。在最適條件下培養9 h,該酶平均酶活力為122.7 U/mL,高于王磊[41]分離于芽孢桿菌的α-淀粉酶(6.4～10.4 U/mL);同時高于來源于ThermococcussiciuliHJ21[42]的高溫酸性α-淀粉酶(19.6 U/mL)。作為分離自熱液區菌株的α-淀粉酶,不僅具有對高溫的耐受性,還具有中溫的最適反應溫度,在輕工業節能生產方面有較大的應用價值。本研究分離獲得的菌株TVG11-1為食品工業降解淀粉提供了菌種資源,其對淀粉降解能力的基因資源有待進一步開發和利用。

[1]Pandey A,Nigam P,Soccol CR,et al. Advances in microbial amylases[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry,2000,31(Pt 2)(2):135-152.

[2]Vieille C,Zeikus GJ. Hyperthermophilic enzymes:sources,uses,and molecular mechanisms for thermostability[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2001,65(1):1-43.

[3]Atomi H. Recent progress towards the application of hyperthermophiles and their enzymes[J]. Current Opinion in Chemical Biology,2005,9(2):166-173.

[4]Li L,Yang J,Li J,Long L,et al. Role of two amino acid residues’ insertion on thermal stability of thermophilicα-amylase AMY121 from a deep sea bacteriumBacillussp. SCSIO 15121[J].Bioprocess and Biosystem Engineering,2015,38(5):871-879.

[5]Yang Jian,Li L,Xiao Y,et al. Identificationand thermoadaptation engineering of thermostability conferring residue of deep sea bacterialα-amylase AMY121[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2016,126:56-63.

[6]Zhang JW,Zeng RY. Purification and characterization of a cold-adaptedα-amylase produced byNocardiopsissp. 7326 isolated from Prydz Bay,Antarctic[J]. Marine Biotechnology,2007 10(1):75-82.

[7]Jiang T,Cai M,Huang M,et al. Characterization of a thermostable raw-starch hydrolyzingα-amylase from deep-sea thermophileGeobacillussp.[J]. Protein Expression and Purification,2015,114:15-22.

[8]Zhou G,Jin M,Cai Y,et al. Characterization of a thermostable and alkali-stableα-amylase from deep-sea bacteriumFlammeovirgapacifica[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,80:676-682.

[9]Song Q,Wang Y,Yin C,et al. LaaA,a novel high-active alkalophilicα-amylase from deep-sea bacteriumLuteimonasabyssiXH031T[J]. Enzyme and Microbial Technology,2016,90:83-92.

[10]Lim WJ,Park SR,An CL,et al. Cloning and characterization of a thermostable intracellularα-amylase gene from the hyperthermophilic bacteriumThermotogamaritimaMSB8[J]. Research in Microbiology,2003,154(10):681-687.

[11]Seong-Ae Y,Ryu SI,Lee SB,et al. Purification and characterization of branching specificity of a novel extracellular amylolytic enzyme from marine hyperthermophilicRhodothermusmarinus[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,18(3):457-464.

[12]Wang S,Lu Z,Lu M,et al. Identification of archaeon-producing hyperthermophilicα-amylase and characterization of theα-amylase[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2008,80(4):605-614.

[13]Homaei A,Ghanbarzadeh M,Monsef F. Biochemical features and kinetic properties ofα-amylases from marine organisms[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016,83:306-314.

[14]Hiteshi K,Gupta R. Thermal adaptation ofα-amylases:A review[J]. Extremophiles,2014,18(6):937-944.

[15]Sharga BM,Lyon GD.BacillussubtilisBS 107 as an antagonist of potato blackleg and soft rot bacteria[J]. Canadian Journal of Microbiology,1998,44(8):777-783.

[16]Larkin MA,Blackshields G,Brown NP,et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics,2007,23(21):

2947-2948.

[17]Myung IJ. Tutorial on maximum likelihood estimation[J]. Journal of Mathematical Psychology,2003,47(1):90-100.

[18]Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry,1959,31(3):426-428.

[19]Hewitt DCJ,Solomons GL.The production ofα-amylase(E.C.3.2.1.1.)byBacillusamyloliquefaciens,in a complex and a totally defined synthetic culture medium[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,1996,17(2):96-99.

[20]Hillier P,Wase DAJ,Emery AN,et al. Instability ofα-amylase production and morphological variation in continuous culture ofBacillusamyloliquefaciens,is associated with plasmid loss[J]. Process Biochemistry,1997,32(1):51-59.

[21]Konsula Z,Liakopoulou-Kyriakides M. Hydrolysis of starches by the action of anα-amylase fromBacillussubtilis[J]. Process Biochemistry,2004,39(11):1745-1749.

[22]Gangadharan D,Sivaramakrishnan S,Nampoothiri KR,et al. Response surface methodology for the optimization of alpha amylase production byBacillusamyloliquefaciens[J]. Bioresource Technology,2008,99(11):4597-4602.

[23]Demirkan ES,Mikami B,Adachi M,et al.α-Amylase fromB.amyloliquefaciens:purification,characterization,raw starch degradation and expression inE.coli[J]. Process Biochemistry,2005,40(8):2629-2636.

[24]Alikhajeh J,Khajeh K,Ranjbar B,et al. Structure ofBacillusamyloliquefaciensα-amylase at high resolution:Implications for thermal stability[J]. Acta Crystallographica,2010,66(Pt 2):121-129.

[25]Liu Y,Shen W,Shi GY,et al. Role of the calcium-binding residues Asp231,Asp233,and Asp438 in alpha-amylase ofBacillusamyloliquefaciensas revealed by mutational analysis[J]. Current Microbiology,2010,60(3):162-166.

[26]Deb P,Talukdar SA,Mohsina K,et al. Production and partial characterization of extracellular amylase enzyme fromBacillusamyloliquefaciens,P-001[J]. Springer Plus,2013,2(1):154.

[27]Zonouzi R,Khajeh K,Monajjemi M,et al. Role of the salt bridge between Arg176 and Glu126 in the thermal stability of theBacillusamyloliquefaciensα-amylase(BAA)[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,23(1):7-14.

[28]Igarashi K,Hatada Y,Hagihara H,et al. Enzymatic Properties of a novel liquefyingα-amylase from an alkaliphilicBacillusisolate and entire nucleotide and amino acid sequences[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(9):3282-3289.

[29]Sodhi HK,Sharma K,Gupta JK,et al. Production of a thermostableα-amylase fromBacillus,sp. PS-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the hydrolysis of malt starch for alcohol production[J]. Process Biochemistry,2005,40(2):525-534.

[30]Lee J,Parulekar SJ. Enhanced production ofα-amylase in fed-batch cultures ofBacillussubtilis TN106[pAT5][J]. Biotechnology and Bioengineering,1993,42(10):1142-1150.

[31]Mc Mahon HE,Kelly CT,Fogarty WM. Effect of growth rate on alpha-amylase production by Streptomyces sp. IMD 2679[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1997,48(4):504-509.

[32]Lin Long-Liu,Chyau Charng-Cherng,Hsu Wen-Hwei. Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilicBacillussp. TS-23[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry,1998,28(Pt 1)(1):61-68.

[33]Teodoro,Souzamartins CED,Leal ML. Culture conditions for the production of thermostable amylase byBacillussp[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2000,31(4):298-302.

[34]HatadaY,Masuda YN,AkitaM,et al. Oxidatively stable maltopentaose-producingα-amylase from a deep-seaBacillus,isolate,and mechanism of its oxidative stability validated by site-directed mutagenesis[J]. Enzyme & Microbial Technology,2006,39(6):1333-1340.

[35]Kim TU,Gu BG,Jeong JY,et al. Purification and characterization of a maltotetraose-forming alkalineα-amylase from an alkalophilicBacillusstrain,GM8901[J]. Applied & Environmental Microbiology,1995,61(8):3105-3112.

[36]Lo HF,Lin LL,Chen HL,et al. Enzymatic properties of a SDS-resistantBacillussp. TS-23α-amylase produced by recombinantEscherichiacoli[J]. Process Biochemistry,2001,36(9):743-750.

[37]Arellanocarbajal F,Olmossoto J. Thermostable alpha-1,4-and alpha-1,6-glucosidase enzymes fromBacillussp. isolated from a marine environment[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2002,18(8):791-795.

[38]Vidilaseris K,Hidayat K,Retnoningrum DS,et al. Biochemical characterization of a raw starch degradingα-amylase from the Indonesian marine bacteriumBacillus,sp. ALSHL3[J]. Biologia,2009,64(6):1047-1052.

[39]Kalpana BJ,Pandian SK. Halotolerant,acid-alkali stable,chelator resistant and raw starch digestingα-amylase from a marine bacteriumBacillussubtilisS8-18[J]. Journal of Basic Microbiol,2014,54(8):802-811.

[40]Asoodeh A,Chamani J,Lagzian M. A novel thermostable,acidophilic alpha-amylase from a new thermophilic “Bacillussp. Ferdowsicous” isolated from Ferdows hot mineral spring in Iran:Purification and biochemical characterization[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2010,46(3):289-297.

[41]王磊,陳宇飛,楊柳. 產淀粉酶芽孢桿菌的分離和鑒定[J]. 食品研究與開發,2017,38(6):175-178.

[42]Ying Q,Zhang C,Guo F,et al. Secreted expression of a hyperthermophilicα-amylase gene fromThermococcussp. HJ21 inBacillussubtilis[J]. Journal of Molecular Microbiology & Biotechnology,2012,22(6):392-398.