響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿蓬多糖的脫色工藝

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(1.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000; 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

堿蓬(Suaedasalsa)又名翅堿蓬,俗稱黃須菜,屬黎科,為一年生葉肉質(zhì)化真鹽生草本植物,具有極強的生命力,屬于一種典型的鹽生結(jié)構(gòu)[1]。鹽地堿蓬的藥用價值早在《本草綱目拾遺》中就有記載,“鹽蓬,味咸性寒,清熱消積”[2]。常食用堿蓬有助于人體酸堿平衡,近年來一些研究表明,堿蓬提取物具有降低膽固醇、降血脂、抗免疫[3-5]、抗衰老、抗腫瘤等功效,對于保健及功能藥物的開發(fā)具有重要意義[6-7]。多糖是一種廣泛存在于動植物、微生物中的大分子物質(zhì),它不僅在生物體的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用,而且具有多方面的生物活性和功能。隨著科學(xué)研究的發(fā)展,多糖生物功效多樣性的研究正日益成為國內(nèi)外研究的熱點[8-9]。

由于堿蓬多糖本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜,利用傳統(tǒng)工藝提取的堿蓬多糖顏色深,純度低,不利于堿蓬多糖成分的進一步分離和產(chǎn)品的開發(fā)。為了能夠更好的對堿蓬多糖進行深入研究,需要對其進行脫色處理。活性炭吸附法、大孔樹脂法以及雙氧水法等方法是目前最常用的多糖脫色方法。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),已有趙肖通[10]等人利用大孔樹脂法對姬松茸多糖進行脫色,汪榮斌[11]等人利用雙氧水法對青錢柳葉多糖進行脫色,但大孔樹脂法操作較復(fù)雜,且樹脂價格較貴,樣品處理量有限,不利于大規(guī)模應(yīng)用,雙氧水是強氧化劑,容易破壞堿蓬多糖的結(jié)構(gòu),影響其活性[12-14]。與前兩種方法相比,活性炭是最常用的吸附劑,研究發(fā)現(xiàn),活性炭可吸附水解液中相對分子質(zhì)量為500和1000以內(nèi)的色素物質(zhì),并且可以吸附溶液中的某些雜質(zhì),從而達到分離提純的目的[15]。目前,已有單曉菊[16]、吳光杰[12]等人利用活性炭分別對苦豆子多糖、馬齒莧多糖進行脫色。而Box-Behnken實驗設(shè)計作為一種基于統(tǒng)計技術(shù)的優(yōu)化方法,具有預(yù)測性好,便于觀察,精密度高等優(yōu)點[10]。

目前,對堿蓬多糖的分離純化已見報道,但對堿蓬多糖脫色工藝的研究未見報道。因此本文通過利用活性炭對堿蓬多糖進行脫色處理,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken實驗設(shè)計對堿蓬多糖脫色工藝條件進行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

堿蓬遼寧省錦州市沿海灘涂濕地,經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院主任藥師郭斌鑒定為堿蓬屬堿蓬草;活性炭天津市瑞金特化學(xué)品有限公司,批號:20150823;葡萄糖中國食品藥品檢定研究院,批號:110732-201406;95%乙醇、苯酚和濃硫酸等試劑均為分析純。

UV-2550型紫外分光光度計日本島津;LD4-2A(Ⅱ)離心機北京京力公司;真空干燥箱上海一恒科技儀器有限公司;BP 211D型電子分析天平德國Sartorius公司;PHSJ-4A實驗室pH計上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫水浴鍋上海騰方儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1堿蓬多糖的制備取堿蓬的干燥葉300 g粉碎后,過20目篩,得堿蓬粗粉。稱取堿蓬粗粉以80%乙醇回流脫脂2次,每次2 h。提取完畢,過濾,殘渣置于烘箱內(nèi)烘干。殘渣加10倍量水于80 ℃水浴鍋中加熱回流提取2次,每次3 h[6]。浸提后抽濾,離心(3000 r/min,15 min),取上清液濃縮,按Sevag法脫蛋白后,加3倍量的90%乙醇過夜沉淀,離心(2500 r/min,10 min),冷凍干燥24 h,即得堿蓬粗多糖。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105 ℃干燥至恒重,精密稱取20 mg,加水溶解,定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配成濃度0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL分別置于具塞試管中,加蒸餾水補至1 mL,再加入6%苯酚溶液0.5 mL,搖勻,然后沿壁加入濃H2SO42.5 mL,立即搖勻。將6只具塞試管室溫放置15 min后,在490 nm處測定各管吸光度,進行三次平行實驗,取平均值。以葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=1.250C+0.009,r=0.9991。

1.2.3單因素實驗取1.2.1項下堿蓬多糖溶液,脫色條件為:固定反應(yīng)條件為脫色溫度45 ℃、脫色時間30 min、pH2,考察不同活性炭用量(1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%)對多糖脫色率的影響;固定反應(yīng)條件為活性炭用量2.5%、脫色時間30 min、pH2,考察不同脫色溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)對多糖脫色率的影響;固定反應(yīng)條件為活性炭用量2.5%、脫色溫度45 ℃、pH2,考察不同脫色時間(20、25、30、35、40、45、50、55 min)對多糖脫色率的影響;固定反應(yīng)條件為活性炭用量2.5%、脫色溫度45 ℃、脫色時間30 min,考察不同pH(1、2、4、6、8、10)對多糖脫色率的影響。以上每組單因素實驗均進行3次重復(fù)實驗取平均值,以考察各因素變量對堿蓬多糖溶液脫色率的影響。

1.2.4Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用中心組合實驗Box-Behnken設(shè)計方案,選取活性炭用量、脫色溫度、脫色時間、pH四個因素,以堿蓬多糖溶液脫色率為響應(yīng)值,設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼,如表1。

表1　響應(yīng)曲面實驗因素水平表Table 1　Factors and their levels used in the response surface design

1.2.5堿蓬多糖脫色率的測定準(zhǔn)確稱取1.2.1項下堿蓬多糖5 g,加水溶解并定容至500 mL,得堿蓬多糖溶液,于450 nm[17]處測定堿蓬多糖溶液脫色前后的吸光度。計算公式為:

脫色率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

1.2.6堿蓬多糖糖損率的測定利用苯酚-硫酸法[18]測定堿蓬多糖溶液脫色前后的多糖含量。計算公式為:

糖損率(%)=(C脫色前-C脫色后)/C脫色前×100

1.3　數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素實驗結(jié)果

2.1.1活性炭用量對脫色效果的影響由圖1可知,多糖的脫色率呈先增加后降低的趨勢,當(dāng)活性炭加入量為3%時,多糖的脫色率增加幅度較大,當(dāng)活性炭加入量超過3%時,多糖脫色率明顯下降,糖損率隨著活性炭用量的增加隨之增大,原因可能是由于活性炭加入量過大,過量的活性炭可能會對多糖產(chǎn)生少量吸附作用,并且會使脫碳不完全,反而影響多糖的脫色率,綜上所述,實驗選擇活性炭的添加量為3%。

圖1　活性炭用量對脫色效果的影響Fig.1　Influence of amount of activated carbon addition on decolorization effect

圖2　脫色溫度對脫色效果的影響Fig.2　Influence of decolorization temperature on decolorization effect

2.1.2脫色溫度對脫色效果的影響由圖2可知,在35～50 ℃范圍內(nèi),多糖的脫色率隨著溫度的升高上升較快,50 ℃時脫色效果最好,當(dāng)溫度繼續(xù)升高時,脫色率反而下降,糖損率隨著溫度的升高而升高。原因可能是由于溫度升高,多糖溶液的黏度降低,色素分子運動速度加快,進而加速吸附作用,當(dāng)達到平衡點時,溫度過高反而造成了色素的解析[19]。因此50 ℃是比較適宜的脫色溫度。

2.1.3脫色時間對脫色效果的影響由圖3可知,在20～40 min內(nèi),隨著時間的延長,多糖的脫色率上升較快,糖損率上升緩慢,當(dāng)脫色時間超過40 min時,多糖的脫色率緩慢降低,糖損率增長迅速,可能是由于活性炭吸附已經(jīng)達到一定程度,吸附與解吸附處于相對平衡,繼續(xù)延長脫色時間,反而會引起部分被吸附色素的解析,綜合考慮,脫色時間應(yīng)為40 min。

圖3　脫色時間對脫色效果的影響Fig.3　Influence of decolorization time on decolorization effect

2.1.4pH對脫色效果的影響由圖4可知,隨著pH的增加,多糖的脫色率呈先增高后降低的趨勢,在酸性范圍內(nèi)多糖的脫色率較高,說明活性炭在偏酸性條件下脫色效果好,但繼續(xù)降低pH,后期所需要的堿液以指數(shù)倍數(shù)的增加,增加了成本,同時會產(chǎn)生大量的鹽,為后續(xù)脫鹽帶來不便[15],并且糖損率也隨著pH的增大而增大,因此,為獲得較好的脫色效果,選擇pH4為較適宜。

圖4　初始pH對脫色效果的影響Fig.4　Influence of decolorization pH on decolorization effect

2.2　響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件的實驗設(shè)計功能可知,以堿蓬多糖脫色率為響應(yīng)值,以活性炭添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時間(C)、pH(D)為自變量,建立四因素三水平的中心組合設(shè)計包括29個實驗方案,每個實驗方案進行3次平行實驗取平均值,具體的實驗方案及實驗結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2　RSM design and corresponding experimental data

表3　回歸模型及方差分析Table 3　The variance analysis of regression equation

注：**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0.6軟件,通過回歸分析對表2中實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到活性炭添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時間(C)、pH(D)四個因素對堿蓬多糖脫色率(Y)的二次回歸方程為:Y=64.30+0.68A+2.30B+0.99C+0.57D+1.27AD-1.04BC+1.13CD-1.90A2-1.79B2-1.03C2-1.44D2

圖5　活性炭用量與pH交互作用對脫色率的響應(yīng)面分析Fig.5　RSM analysis for interactive effects of amount of activated carbon addition and pH

2.2.3響應(yīng)面圖分析響應(yīng)面分析法是利用合理的實驗設(shè)計,通過對響應(yīng)面等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù),并且可以通過對3D曲面圖的分析,直觀地評價各因素間的交互作用[20-21]。在響應(yīng)面圖中,曲面的傾斜度表明該實驗因素對響應(yīng)值的影響程度,傾斜度越高,即坡度越陡峭,表明該實驗因素對響應(yīng)值的影響越顯著。響應(yīng)面等高線圖可以直觀地反映出兩個因素間交互效應(yīng)的強弱,等高線的形狀越接近橢圓形,表示兩個因素交互效應(yīng)越強,而圓形則反之[22]。如圖5～7所示,各圖響應(yīng)曲面坡度較陡峭,說明AD、BC和CD之間交互作用較強。

圖6　脫色溫度與脫色時間交互作用對脫色率的響應(yīng)面分析Fig.6　RSM analysis for interactive effects of decolorization temperature and decolorization time

圖7　脫色時間與pH交互作用對脫色率的響應(yīng)面分析Fig.7　RSM analysis for interactive effects of decolorization time and pH

圖5表示固定脫色溫度和脫色時間為零水平,活性炭用量和pH對多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。活性炭用量較低時,脫色率隨pH增加呈先上升后下降的趨勢,活性炭用量較高時,脫色率隨溫度增加先上升后下降;固定pH不變時,多糖脫色率隨活性炭用量增加呈先上升后下降的趨勢。通過圖5可以看出,活性炭用量上升的幅度較pH稍陡峭,說明活性炭用量對多糖脫色率的影響較pH稍大。

圖6表示固定活性炭用量和pH為零水平,脫色溫度和脫色時間對多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。由該圖可知,脫色溫度和脫色時間對多糖脫色率的影響是明顯的,因為響應(yīng)曲面坡度陡峭,等高線圖接近圓形,同時也說明它們的交互作用并不明顯。多糖脫色率隨脫色溫度和脫色時間的增加,先上升后緩慢下降,脫色溫度的上升幅度明顯比脫色時間的上升幅度陡峭,說明脫色溫度對多糖脫色率的影響較大。

圖7表示固定活性炭用量和脫色溫度為零水平,脫色時間和pH對多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。脫色時間和pH對脫色率的影響都是明顯的,因為曲面比較陡峭,等高線圖是橢圓形,所以證明它們的交互作用也是明顯的。固定pH不變時,多糖脫色率隨脫色時間的增加呈先上升后下降的趨勢。綜合圖7分析可知,脫色時間上升的幅度較pH稍陡峭,說明脫色時間對多糖脫色率的影響較大。

2.2.4驗證實驗本實驗以堿蓬多糖脫色率為最終考察指標(biāo),根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對所得回歸方程的最優(yōu)預(yù)測值求解,可得活性炭對堿蓬多糖脫色的最佳工藝條件為:活性炭用量3.25%,脫色溫度52.72 ℃,脫色時間43.18 min,pH5.39,活性炭脫色率的理論預(yù)測值為68.52%。考慮實際條件,調(diào)整為活性炭用量3.3%,脫色溫度53 ℃,脫色時間43 min,pH5.4。在上述最優(yōu)條件下進行重復(fù)3次平行實驗,驗證實驗所得平均脫色率為65.38%,RSD為1.74%。結(jié)果表明,經(jīng)過響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明本實驗建立的二次多項回歸方程模型能準(zhǔn)確預(yù)測各因素與效應(yīng)面之間的關(guān)系。

3　結(jié)論

多糖溶液中色素成分大部分為天然產(chǎn)物中已存在的物質(zhì),對多糖溶液進行脫色有利于提高多糖的純度,優(yōu)良的脫色劑應(yīng)具有較理想的脫色效果、較低糖損率,同時又容易在多糖中清除,但是要保證脫色前后多糖的結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變。活性炭為黑色多孔顆粒,無臭、無味、無毒,具有孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達、比表面積大和吸附能力強的特點,活性炭對水溶性色素具有穩(wěn)定可靠地脫色效果[12],因此常常被用來做吸附劑。

本實驗利用活性炭對堿蓬多糖溶液進行脫色處理,降低了色素含量,在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計,根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,對堿蓬多糖的脫色工藝進行優(yōu)化,建立了多糖脫色率的回歸模型,由該模型優(yōu)化的堿蓬多糖脫色的最佳工藝條件為:活性炭添加量3.3%,脫色溫度53 ℃,脫色時間43 min,pH5.4。此條件下,堿蓬多糖的平均脫色率為65.38%,與模型預(yù)測結(jié)果相近,表明該響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件具有實用價值,有利于堿蓬多糖的進一步研究和產(chǎn)品的開發(fā)。

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