鏈格孢霉毒素的分析方法及其毒理機制研究進展

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(1.貴州師范大學貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室,貴州貴陽 550001;2.貴州師范大學國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心,貴州貴陽 550001；3.貴州師范大學貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室,貴州貴陽 550001)

圖1　典型鏈格孢霉毒素的化學結構Fig.1　Chemical structure of typical Alternaria mycotoxins

鏈格孢霉菌(Alternariaspecies)是普遍存在的病原體和腐生菌,具有寄生、腐生以及植物致病性,且適宜在低溫下繁殖生長[1]。鏈格孢霉菌可以產生多種代謝產物,統稱為鏈格孢霉毒素。蘋果、柑橘、番茄、蘿卜、高粱、小麥、飼料等果蔬和谷物,均可在田間、運輸或冷藏環境下受到霉菌的污染而腐敗,繼而產生并累積鏈格孢霉毒素[2]。研究表明,有些鏈格孢霉毒素對動植物具有急性和亞急性毒性、細胞毒性、致畸致癌性及胚胎毒性等毒性,有些與食道癌密切相關,因此應當引起重視[3-4]。近年來,對于鏈格孢霉毒素的理化性質、分析方法都有所進展,在毒理機制方面也有相關的報道。本文就鏈格孢毒素的分類、理化性質,常見的分析方法和毒理機制等方面進行了綜述。

1　鏈格孢霉毒素簡介

目前已知的具有明顯毒性的鏈格孢霉毒素有70多種,人和動物攝入被鏈格孢毒素污染的谷物及飼料可導致急性或慢性中毒,從食物中檢出的鏈格孢霉毒素有主要有交鏈孢酚(alternariol,AOH)、交鏈孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交鏈孢烯(altenuene,ALT)、細交鏈孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)、AAL毒素(Alternaria alternata,AAL-toxin),交鏈孢毒素(Altertoxin,ATXs)和騰毒素(Tentoxin,TEN)等[5-6]。化學結構如圖1所示。

根據鏈格孢霉毒素的結構,可以將其分為5大類。二苯并吡喃酮類及其衍生物:如典型化合物AOH、AME、ALT;二萘嵌苯及其衍生物:如典型化合物ATX-I、ATX-II、ATX-III;細交鏈格孢菌酮酸及其衍生物:如典型化合物TeA;一系列長鏈氨基多元醇的丙三羧酸酯類化合物:如典型化合物AAL毒素;混雜結構:一種環形四肽,如典型化合物TeN[7-8]。典型鏈格孢霉毒素的分類及理化性質如表1所示。

2　鏈格孢霉毒素的分析方法

鏈格孢霉毒素的檢測方法有很多,主要有薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)[10-11]、氣相色譜法(gas chromatography,GC)、氣相色譜質聯用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)[12-13]、液相色譜法(liquid chromatography,LC)、液相色譜質聯用法(liquid chromatography-mass spectrometer,LC-MS)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[14-17]及其他技術如酶聯免疫吸附測定(ELISA)技術[18]等。

2.1　薄層色譜法

TLC作為一種簡單快速的定性分析方法已被用于各種分析領域,也一直應用于鏈格孢霉屬真菌毒素的測定。Matysikl[19]采用薄層色譜法和光密度計測定番茄和覆盆子中鏈格孢霉毒素。結果得到分析時間為30 min,Rf值分別是AOH=43和AME=72,以此得出可應用于鏈格孢霉毒素的檢測。此法雖簡單快速,但隨機誤差大,重復性較差,近些年應用較少,已逐漸被其他方法所替代。

2.2　氣相色譜法及氣質聯用法

表1　典型鏈格孢霉毒素的分類及理化性質Table 1　Classification and physical-chemical properties of typical Alternaria mycotoxins

GC聯用不同的檢測技術也已經應用于鏈格孢霉屬真菌毒素的檢測。GC特別是GC-MS,不僅具有高靈敏度和選擇性,而且可以檢測混合物中的某些物質。它適合檢測非極性和半極性化合物,揮發性和半揮發性化合物。Harvan等[20]采用氣相色譜法,利用火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID),以三甲基硅烷乙酰胺∶三甲基硅烷∶吡啶(6∶2∶9)為衍生劑測定TeA,該方法的檢出限為0.1 μg/g。盡管GC/GC-MS方法靈敏度優異,但這些方法還沒有廣泛應用于鏈格孢真菌毒素檢測,主要原因是:樣品制備的鏈格孢霉菌毒素大多需要衍生化,衍生化會導致重復性差,耗時,成本高等缺點。

2.3　液相色譜法及液質聯用法

近年來,液相色譜法聯用其他技術如紫外檢測器(ultraviolet absorption detector,UVD)、二極射線管檢測器(diode array detector,DAD)、熒光檢測器(fluorescence detector,FLD)、電化學檢測器(electrochemical detect,ECD)、蒸發光散射檢測器(evaporative light-scattering detector,ELSD)和質譜(mass spectrometry,MS)已經廣泛應用于檢測鏈格孢霉毒素。目前在真菌毒素檢測的實際工作中,為提高檢測效率和準確性,液相色譜通常與質譜聯用,其聯用技術是目前真菌毒素檢測中應用最廣泛的技術,此技術結合了色譜和質譜兩者的優點,使得真菌毒素的檢測工作更加快速、高效[21]。Liu等[22]采用穩定同位素稀釋液LC-MS/MS的方法檢測鏈格孢霉毒素的騰毒素、二氫麥角毒素等,結果得出:檢出限范圍為0.10～0.99 μg·kg-1,日內/日間相對標準偏差低于8.8%,回收率在98%～115%之間。目前,根據質檢總局關于出入境檢驗檢疫行業標準中SN/T4259-2015,出口水果蔬菜中鏈格孢霉毒素的測定也多采用液質聯用方法檢測。LC-MS,特別是基于電噴霧(electrospray ionization,ESI)離子源的LC-MS/MS或LC-MSn,對于鏈格孢霉毒素的檢測發揮了重要的作用。

2.4　其他技術

2.4.1ELISA技術GC-MS和LC-MS等分析方法需要昂貴的設備和高素質的技術人員,而ELISA技術具有操作簡單、小型化、快速性和可移植性的特點,可以避免上述儀器分析方法的弱點。它已經成為快速測定鏈格孢霉毒素在內的真菌毒素的檢測方法。到目前為止,ELISA方法已有被用于檢測AAL、AOH和TeA等毒素。馬良等[23]采用自制的抗細交鏈格孢菌酮酸(TeA)多克隆抗體,建立了以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫為發光體系的間接競爭化學發光酶聯免疫分析方法定量檢測谷物中TeA毒素,得出最低檢出限為0.010 ng·mL-1,線性范圍0.0323～0.244 ng·mL-1,在面粉和燕麥中的平均加標回收率為82.4%～96.1%和81.5%～93.4%,批內變異系數與批間變異系數均小于12%,與液質方法比較準確度無顯著差異,與其他幾種食品中的常見真菌毒素無交叉反應,可快速、準確、靈敏地測定谷物中TeA檢測。Gross等[24]用琥珀酸酐對TeA進行衍生化,以活性酯法將其與鑰孔血藍蛋白偶聯成人工抗原,采用TeA-KLH偶聯物篩選得到多克隆抗體,并利用此多克隆抗體構建直接競爭性酶聯免疫吸附方法,此方法對TeA具有一定的靈敏性。

2.4.2逆流色譜(Countercurrent chromatography,CCC)技術CCC技術是以分析物在液-液兩相溶劑中的分配差異為核心的快速分離技術。Fan等[25]使用離子液體改性逆流色譜法作為預處理方法,然后通過高效液相色譜法測定葡萄酒和果汁中的鏈格孢真菌毒素。該方法提供了高回收率的鏈格孢霉毒素,具有良好的重現性和低檢測限,已被連續應用于實際蘋果汁和葡萄酒樣品中鏈格孢霉毒素的測定。研究者分析了當地市場共12種葡萄酒樣品和15種蘋果汁樣品,結果樣品中AOH和AME的檢出率均在50%以上。所采取的方法簡單、快速、靈敏,可用于分析和監測其他食品樣品中的鏈格孢霉菌素。

2.4.3電化學技術到目前為止,電化學方法用于檢測的鏈格孢真菌毒素只報告一次[26]。研究人員使用蘑菇改性的碳糊電極酪氨酸酶定量檢測AOH和AME通過電化學方法[27],結果表明AME和AOH都是底物蘑菇酪氨酸酶。此外,該方法具有低噪聲,并且具有容易和快速的電極表面更新。

3　鏈格孢霉毒素的毒理機制

鏈格孢毒素對動植物的毒性作用機制研究表明,人和動物食用被其污染的食物和飼料會面臨急性、慢性毒性、致畸、致突變性、致癌性和致死性等風險。不同的鏈格孢霉毒素,毒性及毒理機制存在差異,研究鏈格孢霉毒素的毒理機制,對于預防和控制其致毒具有重要的意義。

表2　典型鏈格孢霉毒素的毒性及毒理機制Table 2　Toxicity and toxicological mechanism of typical Alternaria mycotoxins

3.1　交鏈孢酚(AOH)

AOH具有基因毒性、協同作用、遺傳毒性、致突變性、細胞毒性、胚胎毒性、致癌性。AOH和AME都能夠增加DNA斷裂的速率,且它們之間表現出協同作用。AOH抑制DNA刺激拓撲異構酶I,IIα和IIβ的DNA切割活性[28],破壞中國倉鼠成纖維細胞(V79)、人類肝癌細胞(HepG2)、人結腸癌細胞(HT29)和人肺癌細胞(A431)的DNA完整性。遺傳毒性和致突變性表現為AOH能造成細胞周期停滯和細胞凋亡[29]。Fernández等[30]研究表明AOH可導致人結腸癌細胞(caco-2)發生氧化應激反應,但僅在高濃度中表現出細胞毒性。胚胎毒性表現為AOH和AME的混合物及單劑量的AOH可導致仔鼠畸形,并可觀察到兩者之間的協同作用[3]。AOH還具有致癌性。Liu等[31]發現AOH能引起食道上皮細胞增殖,并且能引起胚胎食道鱗狀細胞癌變。

3.2　交鏈孢酚單甲醚(AME)

AME具有致畸性、致突變性、胚胎毒性、致癌性、誘變性及其協同作用。研究表明,高劑量的AME胎鼠平均體重減少,內臟嚴重壞死。AOH和AME可能引起細胞致突變性,可誘導胎兒食道的鱗狀細胞癌。AME可以增強AOH的胚胎毒性,同時,AOH也可以增強AME的胚胎毒性。致癌性表現為經AME和AOH處理的人胚胎食管上皮細胞中可檢出活化的癌基因等。研究表明,在沙門菌實驗中無代謝激活AME有弱誘變性。AME和AOH還具有協同作用[32],單獨的AOH或AME對HeLa細胞的毒性作用之和比它們的混合物的毒性作用要弱。Bensassi等[33]將人結腸癌細胞HCT116置于AME中,證明AME通過激活細胞凋亡的線粒體通路誘導人結腸癌細胞的死亡。

3.3　交鏈孢菌酮酸(TeA)

TeA具有急性毒性、亞急性毒性、潛在致癌性、胚胎毒性、致死性、細胞毒性以及協同作用,其毒癥狀為腹瀉、肌肉震顫和驚厥。TeA毒素水平居各鏈格孢霉毒素之首,被美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)列入有毒化學物質登記冊中[34]。TeA致癌性表現為每天按照25 mg·kg-1BW TeA喂養小鼠10個月,食道出現癌癥前期變化[35]。Griffin等[36]給7日齡的雞胚每隔一天注射100 μL的TeA,觀察雞胚發育情況,第23天后,雞胚全部死亡。TeA有致死性。David等[37]發現TeA和ATX-I會導致大鼠和雞死亡。此外,致死性表現在哺乳動物食道和胃腸道大面積出血及循環衰竭、運動功能障礙、死亡。TeA還具有細胞毒性。Zhou等[38]通過研究TeA對小鼠成纖維細胞(3T3細胞)、中國倉鼠肺細胞(CHL細胞)和人類肝細胞(L-O2細胞)3種哺乳動物細胞系的影響,發現TeA可降低細胞增殖速率并減少總蛋白的含量。在研究高粱中鏈格孢屬代謝產物的毒性時發現,只產AOH、AME和ALT的培養物對大鼠和雛雞均無毒性作用,而加入一定量的TeA和ATX-Ⅰ后,卻是致命的[37]。單獨TeA要產生這樣的急性毒性,所需劑量遠遠超過這個加入量,這表明TeA能與其他鏈格孢霉毒素協同作用,產生急性毒性。

3.4　交鏈孢毒素(ATXs)

ATXs具有致突變性、誘變性、細胞毒性。ATX具有致突變性、誘變性。在鼠傷寒沙門氏菌艾姆斯實驗中ATX-II有明顯致突變性。ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ和ATX-Ⅲ均表現誘變性,其中ATX-Ⅲ對沙門菌TA98的誘變性最強,其次是ATX-I和ATX-Ⅱ。ATX-Ⅰ和ATX-Ⅱ具有細胞毒性。200 mg/kg的ATX-I和ATX-II可引起小鼠中毒甚至死亡,毒癥狀包括倦怠、心內膜下及株網膜下出血等[39]。最近證實了就DNA鏈斷裂而言,ATX-II比AOH更易致變哺乳動物細胞。典型鏈格孢霉毒素的毒性及機制如表2所示。

4　展望

鏈格孢霉毒素是比較常見的真菌毒素之一,越來越多的研究證明,鏈格孢霉毒素存在著一定的協同作用。由于鏈格孢霉毒素的污染的途徑多而廣,嚴重危害了人和動物的健康安全,因此,篩選出高效、快速、簡便的分析方法以及深入研究毒理機制作用都具有重要的意義。

4.1　分析方法

傳統的分析技術如TLC、GC/GC-MS缺點較明顯。LC-MS/MS或LC-MSn已成為鏈格孢霉真菌毒素檢測的主流。然而,液質聯用技術需要大規模設備和高素質的技術人員,它們不能滿足實時、快速的對食品安全領域真菌毒素的檢測。因此,需要開發出更多的類似于ELISA技術快速的方法,用于鏈格孢霉毒素的檢測。隨著進一步發展,今后檢測方法的研究重點應是簡單、便攜、快速、高效。

4.2　毒理機制

現階段,對于鏈格孢霉毒素毒理機制的研究深度參差不齊,交鏈孢菌酮酸(TeA)、交鏈孢酚(AOH)相對較多,而對于如AAL毒素、交鏈孢毒素(ATXs)和騰毒素(TeN)很少,且鏈格孢霉毒素之間的協同作用研究也不全面,今后的研究可以重點放在鏈格孢霉毒素之間的協同作用機制上,這對于有效控制鏈格孢霉毒素的致毒危害及人和動物的健康安全都具有重要意義。

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