毛細管電泳電化學發光在藥物檢測方面的應用研究

齊衍超 陳燕 超海鵬 鞏峰賢

濰坊市食品藥品檢驗檢測中心 山東濰坊 261105

近年來，毛細管電泳在和各種檢測技術的融合運用的過程中體現出良好的分析能力，可分析范圍較廣。但毛細管電泳也存在一些缺點，如它的進樣量很小，需要檢測儀器具備很高的靈敏度，響應速度以及空間分辨能力。因此，人們對檢測器進行了持續研究，近年來，電化學（ECL）技術憑借其簡單、可以實現微型環境的高靈敏檢測的特點，被應用于毛細管電泳分離檢測。1987年，Danielson等人提出Ru(bpy)32+和烷基胺的電化學技術，說明了電化學強度與胺結構的關系[1]。從此Ru(bpy)32+ECL體系逐漸在應含氮化合物分析中得到廣泛應用。而毛細管電泳Ru(bpy)32+電化學發光聯用技術（CE-ECL）兼具高效電泳分離、靈敏電化學發光檢測的功能，在藥物、環境污染等方面的檢測中應用越來越廣泛。

1 毛細管電泳電化學發光CE-ECL在藥物檢測中的應用

1.1 藥物部分

鹽酸硫利噠嗪，又成為鹽酸甲硫達嗪，其化學式為C21H26N2S2·HCl，顏色呈白色或類白色，形態為結晶性粉末，有輕微的臭味，能溶解于乙醇，是一種抗精神病藥。利用CE-ECL分析檢測鹽酸硫利噠嗪可以獲得更高的靈敏度，而且操作簡便，損耗較小。

1.2 試驗部分

鹽酸硫利噠嗪購自中國藥品生物制品檢定所。試驗所需的氯化三聯吡啶耔六水和物購自于J&K化學藥品公司。用Na2HP04、KH2P04配制成pH值不同的一組68mmol/L的磷酸緩沖溶液。試驗所需的水均為蒸餾水，化學試劑的純度基本均在分析純以上，全部試驗所需溶液在使用前都經由水膜過濾處理。

1.3 試驗儀器

電化學分析儀：EC6100型（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）

工作電極：直徑一毫米鉑電極

參比電極：Ag/AgCl電極。

毛細管電泳電化學發光檢測儀：RM02-MPI-A型（北京中西遠大科技有限公司），該檢測儀主要包括四個部分：數控采集分析儀、化學發光檢測器、高壓電源、恒電位儀。

電化學發光檢測池：該檢測池處于發光檢測器中，主要由三電極系統構成，分別為工作電極：直徑300μm的鉑電極；參比電極：Ag/AgCl電極；鉑電極作為對電極。可以將Ru(bpy)32+溶液加入磷酸緩沖液中，但Ru(bpy)32+將吸附于毛細管上，降低毛細管電泳的分析效率。因此，一般情況下都是將Ru(bpy)32+溶液加入到電化學發光檢測池中，在施加制定電位，Ru(bpy)32+將在工作電極表明被氧化成Ru(bpy)32+毛細管末端和工作電極表面的距離應設為100μm。待分析的藥物樣品從毛細管中轉移出來后與Ru(bpy)32+在工作電極表面發生氧化還原反應，生成激發態Ru(bpy)32+，它在恢復到基態的過程中會釋放光子[2]。利用光電倍增管收集光信號。考慮到溶劑會蒸發以及毛細管內部流出溶液的稀釋作用，需要每隔兩個小時更換一次Ru(bpy)32+，以免影響Ru(bpy)32+溶液濃度，大致分析過程受到干擾或產生損耗效應。

未涂層熔融石英毛細管：(50μm×50cm，有效長度41cm)，第一次使用前需要使用將其置于0．1mol/L的NaOH溶液中浸泡二十四小時，取50cm長的未涂層熔融石英毛細管置于兩溶液池之間充當分離通道，在進樣端施加高壓，每次運行前用NaOH沖洗十分鐘，再用緩沖溶液沖洗至CL基線平穩。

1.4 配制標準溶液

在10ml的乙醇中溶解40.7mg的鹽酸硫利噠嗪制取0．01mol/L的鹽酸硫利噠嗪母液，將其放置于冰箱中，溫度控制在4℃。每次開始試驗前，可以用乙醇稀釋鹽酸硫利噠嗪母液，以制得濃度不同的標準溶液。

1.5 結果和討論

在Ru(bpy)32+溶液中鹽酸硫利噠嗪的循環伏安如下圖所示：

圖1 鹽酸硫利噠嗪的循環伏安

如上圖所示，曲線a表示磷酸緩沖溶液中鉑電極的循環伏安圖，由圖可知其沒有氧化還原峰，但是鉑電極Ru(bpy)32+溶液中的循環伏安圖存在非常明顯的氧化還原峰，這個氧化還原峰是Ru(bpy)32+所獨有的。當我們將100Lμ，摩爾濃度為O.01mol/L利用乙醇稀釋制成的鹽酸硫利噠嗪標準溶液加入800Lμ、摩爾濃度為5mmol/LRu(bpy)32+溶液后，將得到如圖1中的曲線c所示與之前明顯不同的循環伏安圖。此時氧化峰的電流增大，而還原峰的電流減小。這是因為Ru(bpy)32+在工作電極的表面發生氧化反應失去一個電子生成Ru(bpy)32+，Ru(bpy)32+從鹽酸硫利噠嗪溶液中得到一個電子恢復成二價態，但是卻呈現出激發態，當處于激發態的Ru(bpy)32+回復到基態的過程中將釋放光子。可見，從某種意義上來說，Ru(bpy)32+濃度明顯增加，自然就會出現氧化峰電流增大、還原峰電流減小的現象，我們可以利用這一現象來檢測鹽酸硫利噠嗪。

1.6 分析條件的優化

根據上述分析可知，當鹽酸硫利噠嗪溶液經由毛細管電泳至電化學發光檢測池中后，光電倍增管將會收集到光信號，根據此原理檢測鹽酸硫利噠嗪。為了增強試驗效果，需要針對影響鹽酸硫利噠嗪電化學發光信號強度以及分離效果的各種因素進行優化，如應用電壓、迸樣電壓、持續進樣時間、磷酸緩沖溶液pH值等。

應用電壓對電化學發光強度的影響。發光試劑氧化速率會影響電化學發光強度，而，工作電極上的應用電壓會影響光試劑氧化速率。應用電壓過低，Ru(bpy)32+難以被氧化，應用電壓上升時，電化學發光強度也會提升，當超過1.2v時電化學發光強度又會降低。因此，1.2V就是最佳的應用電壓。

進樣電壓大小、進樣持續時間長短對電化學發光強度有較大影響，因為分析物的量由進樣電壓、進樣持續時間決定，分析物的量又決定了電化學發光強度。當進樣持續10s，進樣電壓為10kV，電化學強度將顯著增強。

（3）電化學發光反應和pH有直接關系，因此，磷酸緩沖溶液pH值會影響電化學發光強度。在本次試驗中pH值從6.5上升至8.0時，電化學發光強度提升，當pH值超過8．0，時，電化學發光強度減小。

2 結語

綜上所述，本文采用毛細管電泳電化學發光CE-ECL方法構建了操作簡便、結果可靠、復現性好的方法用于檢測鹽酸硫利噠嗪，并針對相關的試驗儀器、試驗條件進行了分析優化。試驗證明該方法可以用于藥物檢測，生物活性的分析。