新疆地方梨品種S基因型的鑒定

張校立，徐葉挺，艾沙江·買買提，許 娟，鄧 莉，王繼勛

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】新疆地方梨品種資源豐富，品種類型獨(dú)特，具有很多優(yōu)異基因資源，是我國(guó)梨樹(shù)資源的重要組成部分之一。最著名品種是庫(kù)爾勒香梨(PyrusbretschneideriRehd)，庫(kù)爾勒香梨原產(chǎn)新疆庫(kù)爾勒地區(qū)，在新疆已有1 400多年的栽培歷史，其果實(shí)香味濃郁、皮薄肉脆、清甜爽口、細(xì)嫩多汁、耐貯藏性強(qiáng)，是新疆名特優(yōu)果品之一，截至2016年，庫(kù)爾勒香梨種植面積達(dá)7.38×104hm2(110.83萬(wàn)畝)，產(chǎn)量達(dá)128.04×104t[1]。香梨產(chǎn)業(yè)已成為庫(kù)爾勒地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。庫(kù)爾勒香梨自交不親合，S基因型為S22S28[2]，自交結(jié)實(shí)率低，需要配置授粉品種，但不同的授粉品種會(huì)對(duì)香梨果實(shí)產(chǎn)生顯著的花粉直感效應(yīng)，突出表現(xiàn)為不同花粉授粉后果實(shí)萼片脫落或宿存，萼片脫落后的幼果發(fā)育成為 “母梨”，萼片宿存的幼果發(fā)育成為“公梨”，二者不但外在品質(zhì)果形上差異很大，而且內(nèi)在品質(zhì)和口感上也差異明顯，市場(chǎng)價(jià)格差異也非常顯著。徐勝利等[3]研究表明，選擇新疆梨作為授粉品種能夠明顯改善香梨果形和果實(shí)品質(zhì)。通過(guò)對(duì)新疆地方梨品種S-等位基因的鑒定，對(duì)庫(kù)爾勒香梨合理授粉品種的選配和豐產(chǎn)栽培具有重要的理論意義。【前人研究進(jìn)展】梨自交不親和性基因的研究始于20世紀(jì)50年代，國(guó)外最早是Kikuchi, Machida和Terami等[4-6]日本學(xué)者，采用廣泛的田間授粉雜交實(shí)驗(yàn)，從日本沙梨中鑒定了7個(gè)S等位基因，命名S1～S7。2000、2001年，Castillo 使用PCR-RFLP系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了S8和S9兩個(gè)新的S等位基[1]。2006年，Kin等[8]又利用PCR-RFLP在梨品種-Chengsilri.中鑒定出S10-RNase新基因。在西洋中, Zisovich 等[9],Takasaki 等[10]與Mota et等[11],利用特異引物和基因克隆的方法已經(jīng)鑒定出Sa～St等17個(gè)S-RNases基因。2009年，Javier[12]在西洋梨品種‘Abugo’ 和 ‘Ceremeno’兩個(gè)品種中,鑒定出了一個(gè)新的自交親和的S-allele：S 21，這個(gè)基因是由S21的突變體。2014年，Azam Nikzad Gharehaghaji. Kazem Arzani等[13]在57個(gè)伊朗的梨品種中鑒定出了3個(gè)新的S-RNase，分別是S126、S127 和 S128。中國(guó)最早是烏云塔娜[14]在2003年，從中國(guó)白梨中分離鑒定了7個(gè)新的S基因，分別記S17、S19、S20、S21、S22、S26、S27等位基因；譚曉風(fēng)等[15]分別從白梨、沙梨及秋子梨等亞洲梨種群分離鑒定了34個(gè)S等位基因；從 2003 年開(kāi)始至今采用 PCR-RFLP、DNA 測(cè)序、雜交檢測(cè)等方法開(kāi)展了中國(guó)梨自交不親和性的研究，發(fā)現(xiàn)了包括 S1～S10基因在內(nèi)的 42個(gè) S 基因，從中國(guó)梨中克隆了 S12、S13、S15、S17～S22、S25～S30、S32、S34、S35、S38～S40、S42、S46等 S 基因全長(zhǎng) cDNA 序列。迄今為止，國(guó)內(nèi)外通過(guò)不同的鑒定方法，大概確定了近500 個(gè)梨品種的 S 基因型，近500個(gè)品種中大部分是白梨系統(tǒng)、秋子梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)的品種，新疆梨系統(tǒng)的品種非常少，目前，只有陳慧等[16]鑒定了黃句句(S22S34)、伊犁紅句句(S22S28)、早熟句句(S17S19)、乃希木特阿木提(S19S28)沙01號(hào)(S22S28)、斯?fàn)柨烁?S22S28)、墨梨(S26 S b)、貴德長(zhǎng)把(S19 S b)等8個(gè)新疆梨系統(tǒng)品種S-基因型。【本研究切入點(diǎn)】新疆梨地方品種是我國(guó)特有的梨樹(shù)資源，資源豐富，具有很多優(yōu)異的基因資源。新疆地方梨品種S基因型的鑒定研究比較少，大部分新疆梨地方梨的S基因型還未鑒定，該研究的9個(gè)新疆地方梨品種的基因型目前尚未見(jiàn)報(bào)道。研究對(duì)新疆地方梨品種S基因型進(jìn)行鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用PCR和DNA 測(cè)序技術(shù)鑒定9個(gè)新疆地方梨品種的S 基因型。9個(gè)品種S 基因型的鑒定，以期豐富我國(guó)梨品種 S 基因型信息，為庫(kù)爾勒香梨篩選最佳的授粉梨品種提供了一定的理論基礎(chǔ)，為庫(kù)爾勒香梨的豐產(chǎn)栽培和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1新疆地方梨品種

供試品種9個(gè)新疆地方梨品種分別為褐色句句梨、輪臺(tái)句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、庫(kù)爾勒黃酸梨、句句梨、 奎克阿木特1號(hào)、可特阿木特和棋盤梨。品種均來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)國(guó)家果樹(shù)資源圃。于2017年4月上旬采集各品種幼嫩葉片置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃ 冷凍保存。

1.1.2試劑

ExTaq、pMD18-T Vector、DNA回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司，DNA 提取試劑盒購(gòu)于天根科技生化化有限公司，其他藥品均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2　方 法

1.2.1基因組 DNA 提取

參照植物基因組 DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(柱式植物DNAout2．0，天根科技生化化有限公司) 提取梨基因組 DNA，在1%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液、3～5 V/cm 下電泳，電泳結(jié)果用上海復(fù)日 FR-980 凝膠圖成像系統(tǒng)照相，檢測(cè) DNA 樣品。

1.2.2PCR 擴(kuò)增及檢測(cè)

根據(jù)已報(bào)道梨的S基因相關(guān)信息, 獲知梨S基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)由5個(gè)保守區(qū)、1個(gè)高頻可變區(qū)及1個(gè)內(nèi)含子組成。高頻可變區(qū)是花粉識(shí)別的部位。S基因多態(tài)性主要源于高頻可變區(qū)的差異, 通常根據(jù)高頻可變區(qū)的差別判斷不同的S基因。因此，根據(jù) S 基因一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用 S 基因高變區(qū)( hypervariable region，HV) 的保守序列設(shè)計(jì)合成引物。

正向引物 PF：(5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3')

反向引物 PR：( 5'-AC( A / G) TTCGGCCAAATAATT-3')

在江南等[17]擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)過(guò)程的基礎(chǔ)上略作調(diào)整，使用ExTaq酶保證擴(kuò)增結(jié)果的可靠性，擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.4% 瓊脂糖凝膠上于100 V電泳30～45 min，上海復(fù)日FR-980凝膠圖像系統(tǒng)分析拍照并記錄分析。

1.2.3PCR 產(chǎn)物回收、克隆、測(cè)序

利用凝膠回收試劑盒回收目的 DNA 片段，與 PEASY-T5載體16℃ 條件下過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，涂于 SOC/Amp50 固體培養(yǎng)基上 37℃ 過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆，菌液 PCR 篩選帶有目的片段長(zhǎng)度的克隆 。每個(gè) S 基因片段挑選 3 個(gè)陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用Blast 與 GenBank 中已知的 S-RNase 基因序列比較，確定其S基因型。

2　結(jié)果與分析

2.1　新疆梨地方梨品種基因組 DNA 提取

利用北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒，提取新疆梨地方梨品種的基因組 DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，具有提取濃度高、純度好，蛋白質(zhì)、RNA 雜質(zhì)含量少特點(diǎn)，通過(guò)稀釋可以直接用于 PCR擴(kuò)增。圖1

注：M. Markers、1.褐色句句梨；2、輪臺(tái)句句梨；3.霍城冬黃梨；4.八月梨；5.庫(kù)爾勒黃酸梨；6.句句梨；7. 奎克阿木特1號(hào)；8.可特阿木特；9. 棋盤梨

Note: M.Markers;1.Hesejujuli;2.Luntaijujuli;3.Huochengdonghuali;4.Bayueli;5.Kuerle- huangsuanli; 6. Jujuli;7.Kuikeamute1hao;8.Keteamute;9.Qipanli

圖19個(gè)新疆地方梨品種基因組DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果
Fig.1The agarose electrophresis result of DNA extracted from nine local pear cultivars in Xinjiang

2.2　新疆梨地方梨品種PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

使用S-allele特異性引物PF和PR將對(duì)新疆地方梨品種的基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，由于PCR 產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳隨遷移率的不同, 表現(xiàn)為不同位置的條帶。研究表明，除奎克阿木特1號(hào)表現(xiàn)出明顯的3條明顯的條帶外，褐色句句梨、輪臺(tái)句句梨、霍城冬黃梨等8個(gè)品種在聚丙烯酰胺凝膠上均呈現(xiàn)2條明顯的條帶。褐色句句梨、輪臺(tái)句句梨、霍城冬黃梨、八月梨等8個(gè)品種的兩條帶都在300～500 bp，奎克阿木特1號(hào)的兩個(gè)條帶在300～500 bp，另外一條帶在600～800 bp。褐色句句梨、輪臺(tái)句句梨、八月梨、句句梨的兩個(gè)擴(kuò)增條帶和奎克阿木特1號(hào)的其中兩個(gè)擴(kuò)增條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的位置相同,其S基因堿基序列是否相同有待進(jìn)一步分析。圖2

2.3　新疆梨地方梨品種S基因型的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳后回收目的條帶、克隆后，將克隆后的陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)定的結(jié)果序列使用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行 Blast 搜索、同源性比較, 根據(jù)分析GenBank內(nèi) S 基因的堿基序列及同源性,確定9個(gè)新疆地方梨品種的 S 基因型。7個(gè)品種中 S 基因的核苷酸序列與 GenBank 中已登錄的梨 S 基因有極高的同源相似性，褐色句句梨的S基因與S28、S4基因的相似性達(dá)98%、99%；輪臺(tái)句句梨的S基因與S28、S4基因的相似性均為100%，霍城冬黃梨的S基因與S28、S4基因的相似性達(dá)100%、99%；八月梨S基因與S28，S4基因的相似性達(dá)99%、100%；庫(kù)爾勒黃酸梨的S基因與S22、S35基因的相似性達(dá)100%、100%；奎克阿木特1號(hào)的S基因與S36、S34、S22基因的相似性達(dá)100%、98%、100%；可特阿木特一個(gè)S基因與S8相似性達(dá)100%，另外，一個(gè)沒(méi)有鑒定出來(lái)，棋盤梨一個(gè)S基因與S28相似性達(dá)99%，另外，一個(gè)也沒(méi)有鑒定出來(lái)。表1

注：M. Markers、1.褐色句句梨、2、輪臺(tái)句句梨、3.霍城冬黃梨、4.八月梨、5.庫(kù)爾勒黃酸梨、6.句句梨、7. 奎克阿木特1號(hào)、8.可特阿木特、9. 棋盤梨

M.Markers;1.Hesejujuli;2.Luntaijujuli;3.Huochengdonghuali;4.Bayueli;5.Kuerle- huangsuanli; 6. Jujuli;7.Kuikeamute1hao;8.Keteamute;9.Qipanli

圖29個(gè)新疆梨地方梨品種S 基因特異擴(kuò)增的 6% 聚丙烯酰胺凝膠電泳
Fig.2The 6% PAGE of PCR amplification of genomic DNA with S gene specific primers on the nine local pear cultivars in Xinjiang表19個(gè)新疆地方梨品種的S基因型
Table1S-genotypes of nine local pear cultivars in Xinjiang

序號(hào)No．品種Cultivars系統(tǒng)System引物PrimersPCR片段長(zhǎng)度ThePCRfragmentsize(bp)S基因型S-genotype1褐色句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S42輪臺(tái)句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S43霍城冬黃梨新疆梨PF/PR428/371S28S44八月梨新疆梨PF/PR428/347S28S45庫(kù)爾勒黃酸梨新疆梨PF/PR346/378S22S356句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S47奎克阿木特1號(hào)新疆梨PF/PR568/342/428S36S34S228可特阿木特新疆梨PF/PR440/xS8Sx9棋盤梨新疆梨PF/PR428/xS28Sx

3　討 論

研究應(yīng)用 PCR和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì) S 基因特異性擴(kuò)增條帶的測(cè)序, 然后通過(guò) blast生物信息軟件對(duì)測(cè)序的DNA序列進(jìn)行分析，由于可特阿木特和棋盤梨各鑒定出一條基因，9個(gè)新疆地方梨品中只能明確確定了 7個(gè)品種 S基因型，結(jié)果為：褐色句句梨 S28S4、輪臺(tái)句句梨S28S4、霍城冬黃梨S28S4、八月梨S28S4、庫(kù)爾勒黃酸梨S22S35、句句梨S28S4、奎克阿木特1號(hào)S36S34S22；可特阿木特和棋盤梨S基因型暫定為S8Sx和 S28Sx。同為新疆地方梨品種，它們之間既有相同之處，也有不同之處，比如：褐色句句梨、輪臺(tái)句句梨，霍城冬黃梨、八月梨、句句梨等5個(gè)品種具有相同的基因型S28S4，它們5個(gè)品種間不能相互作授粉品種，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗤幕蛐停绻嗷ラg作授粉品種，就會(huì)出現(xiàn)不結(jié)果或結(jié)果率極低；庫(kù)爾勒黃酸梨和奎克阿木特1號(hào)2個(gè)品種的基因型不相同，它們?nèi)齻€(gè)品種間可以相互作授粉品種。由于可特阿木特和棋盤梨只鑒定出一個(gè)S基因，沒(méi)有明確確定出其S基因型，因此，可特阿木特和棋盤梨與其它品種間的授粉情況暫不能下定論。這9個(gè)新疆地方梨品種中除可特阿木特外，其它8個(gè)品種都含有庫(kù)爾勒香梨的S基因，色句句梨、輪臺(tái)句句梨，霍城冬黃梨、八月梨、句句梨、棋盤梨等6個(gè)品種含有庫(kù)爾勒香梨的S28，庫(kù)爾勒黃酸梨和奎克阿木特1號(hào)含有庫(kù)爾勒香梨的S22基因，除可特阿木特外，其它8個(gè)新疆地方梨品種都不適宜作庫(kù)爾勒香梨的授粉品種。

在起源上，8個(gè)新疆地方梨品種既然都含有庫(kù)爾勒香梨的S基因，說(shuō)明這 8個(gè)品種與庫(kù)爾勒香梨在起源上有很大的相關(guān)性。另外，鑒定出的9個(gè)新疆地方梨品種的分別含有S4、S8、S22、S28、S34、S35、S36等S基因，這些基因分別屬于白梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)和西洋梨系統(tǒng)的S基因，初步推論新疆地方梨品種可能是白梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)和西洋梨系統(tǒng)的雜種，雜種后代又經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然雜交，互相演化而來(lái)成現(xiàn)在的品種，這個(gè)推論結(jié)果與沈德緒、藤元文等[18，19]的研究結(jié)果大致是相同的；在果樹(shù)育種學(xué)上，沈德緒等[18]認(rèn)為新疆梨可能是西洋梨與白梨的雜交種；藤元文等[19,20]認(rèn)為新疆梨遺傳組成至少包括了白梨或砂梨，西洋梨和杏葉梨，可能是這幾個(gè)種的自然雜交種，另外，他們利用DNA標(biāo)記研究表明原產(chǎn)新疆的所謂杏葉梨屬于西方梨類型；但是，馬兵剛等[20]試驗(yàn)結(jié)果RAPD 數(shù)據(jù)對(duì)新疆梨是否為西洋梨和白梨的雜交種無(wú)法判斷。新疆地方梨品種尤其是庫(kù)爾勒香梨具體的起源與分類還需進(jìn)一步深入的研究與分析，這對(duì)庫(kù)爾勒香梨的品種改良及豐產(chǎn)栽培具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

4　結(jié) 論

通過(guò)PCR和DNA測(cè)序技術(shù)鑒定了9個(gè)新疆地方梨品中的S基因型，確定了7個(gè)新疆地方梨品種S基因型，鑒定的結(jié)果為：褐色句句梨 S28S4、輪臺(tái)句句梨S28S4、霍城冬黃梨S28S1、八月梨S28S4、庫(kù)爾勒黃酸梨S22S35、句句梨S28S4、奎克阿木特1號(hào)S36S34S22；新疆地方梨品S-genotype的鑒定，增加我國(guó)7個(gè)新疆地方梨品種的S-genotype信息，為新疆地方梨品種尤其是庫(kù)爾勒香梨起源與分類提供了一定的理論支持，為庫(kù)爾勒香梨的的豐產(chǎn)栽培和品種改良提供了指導(dǎo)依據(jù)，為庫(kù)爾勒香梨授粉品種的篩選新疆地方梨品種提供理論依據(jù)。

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