轉(zhuǎn)Bt Cry1Ac基因抗蟲棉花外源基因漂移研究

李海強(qiáng)，李號賓，王冬梅，汪 飛，丁瑞豐，潘洪生，阿克旦·吾外士，劉 建

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)部庫爾勒作物有害生物綜合觀測實驗站，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，從20世紀(jì)90年代起，已有不同品種的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉進(jìn)行了商業(yè)化種植[1-4]。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植，在帶來巨大效益的同時，也面臨著轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)安全問題[5-6]。其中，外源基因向非轉(zhuǎn)基因植物逃逸的生態(tài)風(fēng)險，以及轉(zhuǎn)基因作物花粉的基因漂移產(chǎn)生的生態(tài)后果，是轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)風(fēng)險評估及其生態(tài)影響監(jiān)測的主要內(nèi)容[7-8]。棉花是常異花授粉，花朵較大，易造成外媒傳粉的發(fā)生。雖然棉花自身的傳播距離十分有限，但如果借助昆蟲和風(fēng)力的傳播就可使得漂移距離明顯提高。基因漂移是生物進(jìn)化的一個重要過程和非常普遍的自然現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因植物向野生的相同種群漂移導(dǎo)致的影響仍不明確。【前人研究進(jìn)展】影響基因漂移的因子有很多，包括植物種類(Johnson,2006；Bonnett, 2008)、花粉的產(chǎn)量(Alexis ,2011)、氣候因子(王天宇，2001)、傳粉昆蟲(Allen,2005)、轉(zhuǎn)基因作物種植面積(Scheffer,1995)等[9-14]。轉(zhuǎn)基因植物花粉傳播距離和基因漂移率是目前基因漂移研究的主要內(nèi)容。【本研究切入點】新疆棉區(qū)是我國重要的棉花生產(chǎn)基地，隨著轉(zhuǎn)基因棉花的引進(jìn)和大面積種植，對其生態(tài)安全性的影響研究也顯得非常迫切。新疆氣候與土壤條件與內(nèi)地相比有極大的差異，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種植和研究均晚于內(nèi)地，對轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因棉花外源基因漂移規(guī)律的研究鮮有報道。研究轉(zhuǎn)BtCry1Ac基因棉花外源基因漂移規(guī)律。【擬解決的關(guān)鍵問題】2014～2015年在新疆吐魯番市研究了轉(zhuǎn)Bt基因棉花外源基因Cry1Ac，從其種植小區(qū)向周圍常規(guī)棉花的漂移情況，為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花基因流的風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材 料

研究采用的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉為GK19和SGK321，分別含有單價的BtCry1Ac基因和雙價的BtCry1Ac+ CpTI基因，兩個品種同時也含有抗卡納霉素標(biāo)記基因。常規(guī)棉為吐魯番地區(qū)主要栽培品種岱棉80。轉(zhuǎn)基因棉花材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2　方 法

1.2.1基因漂移試驗田間種植和取樣

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉SGK321 和GK19外源基因Cry1Ac的漂移試驗，于2014年分別在吐魯番市原種場(E89.3387，N42.8695)和吐魯番市二堡鄉(xiāng)(E89.5000，N42.9135)進(jìn)行。吐魯番市原種場試驗地面積約12 hm2(180畝)，為近似平行四邊形地塊，其周圍1 km之內(nèi)沒有其他棉田。在試驗地中部種植面積為5 m×5 m=25 m2的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉SGK321小區(qū)一個，其余均種植當(dāng)?shù)刂髟云贩N岱棉80。吐魯番市二堡鄉(xiāng)試驗地面積約10 hm2(150畝)，近似長方形地塊，周圍1 km之內(nèi)沒有其他棉田。在試驗地中部種植面積為5 m×5 m=25 m2的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK19小區(qū)一個，其余均種植當(dāng)?shù)刂髟云贩N岱棉80。棉花栽培和田間管理方法均按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)棉花生產(chǎn)技術(shù)管理。棉花成熟收獲時，在抗蟲棉小區(qū)東、南、西、北4個方向上距小區(qū)邊緣1、3、5、7、10、15、20、25、30、40、50、70、90和120 m處，分別采摘岱棉80吐絮的棉鈴45個，單鈴編號分開保存，分開軋花，軋花后得到的種子也按編號的單鈴分開保存。

1.2.2外源基因檢測

2015年4月，將2010年單鈴收獲的種子種植于庫爾勒市托布力其鄉(xiāng)大田。每一個棉鈴的種子種植一行，插牌標(biāo)記。在棉花生長到2～3片真葉時，用1%的卡那霉素溶液涂抹每株棉花上的一張葉片，第5 d觀察葉片變色情況，并根據(jù)變色情況初步判斷植株中是否含有外源基因。如果葉片上涂抹過卡那霉素的地方變黃甚至產(chǎn)生枯斑，則說明不會含外源基因；如果不變色，則說明可能含有外源基因[7]。采集涂抹后未變色的棉株上的葉片，采用改良的CTAB法提取棉葉總DNA，選用特異性引物對樣品內(nèi)的Cry1Ac外源基因進(jìn)行PCR定性檢測。上下游引物分別為5＇GAAGGATTGAGCAATCTCTAC 3＇和5＇AATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3＇。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix(北京英俊生物科技有限公司)10 μL,上下游引物各0.5 μL(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，DNA模板2 μL，雙蒸水7 μL[4]。如果棉葉總DNA中含有Cry1Ac外源基因，則說明發(fā)育出該棉株的種子中含有Cry1Ac外源基因，進(jìn)而說明產(chǎn)生該種子的棉鈴也含有Cry1Ac外源基因。

1.3　數(shù)據(jù)處理

根據(jù)每株棉花Cry1Ac外源基因檢測結(jié)果，計算1.2.1試驗步驟中每個取樣點的Cry1Ac外源基因漂移情況。外源基因漂移主要研究種子外源基因漂移，1.2.1試驗步驟中每個取樣點可以得到含有Cry1Ac外源基因的種子數(shù)、不含Cry1Ac外源基因的種子數(shù)、種子外源基因漂移率等數(shù)據(jù)。

種子外源基因漂移率%=取樣點上含有Cry1Ac外源基因的種子數(shù)/取樣點上取到的總種子數(shù)×100。

根據(jù)1.2.1試驗步驟中各個取樣點的距離、方向、外源基因漂移數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistics 17.0軟件，建立Cry1Ac外源基因漂移的二項分類Logistic回歸預(yù)測模型，分析取樣距離、取樣方向與外源基因漂移之間的關(guān)系。預(yù)測變量為取樣距離和取樣方向。取樣距離為連續(xù)區(qū)間變量。取樣方向為無序分類變量，采用Indicator啞變量編碼方法，將每一個方向轉(zhuǎn)化為以北方為參照的3個啞變量，即方向(1)、方向(2)、方向(3)，東方的三個啞變量為(1，0，0)、南方的三個啞變量為(0,1,0)、西方的三個啞變量為(0,0,1)，北方的三個啞變量為(0，0，0)。應(yīng)變量為外源基因漂移情況，為二項分類數(shù)據(jù)，1代表發(fā)生Cry1Ac基因漂移，0代表未發(fā)生Cry1Ac基因漂移。由于檢測的種子數(shù)很多，將數(shù)據(jù)按頻數(shù)表的形式輸入，頻數(shù)為應(yīng)變量結(jié)果相同的鈴數(shù)或種子數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同方向和不同距離上的外源基因Cry1Ac漂移率

2.1.1不同距離上的種子漂移率

研究發(fā)現(xiàn)在距離轉(zhuǎn)基因棉花SGK321小區(qū)邊緣1、3、5、7、10、15、20、25、30、40、50、70、90、120 m均能檢測到都含有外源基因Cry1Ac種子，種子漂移率范圍為0～5%，最小值為東向20 m，南向30 m，西向90 m和北向90 m，取值均為0。最大值為南向1 m處，達(dá)到了5%。而南、西和北向120 m處由于試驗地原因，沒有采集到基因漂移的種子。圖1

研究表明，距離轉(zhuǎn)基因棉花GK19小區(qū)邊緣1、3、5、7、10、15、20、25、30、40、50、70、90、120 m均能檢測到都含有外源基因Cry1Ac種子。取值范圍為0～10.09%，其中東向1、3、5、15 m，南向15 m，西向7 m，北向1、3、7、25、90 m取值均為0。西向距離轉(zhuǎn)基因棉花GK19小區(qū)邊緣40 m處漂移率為最高達(dá)到了10.09%。 圖2

圖1SGK321的Cry1Ac基因在東(E)、南(S)、西(E)、北(N)四個方向不同距離種子漂移率
Fig.1The seed frequency of transgenic Cry1Ac cotton SGK321 in different direction and distance

圖2GK19的Cry1Ac基因在東(E)、南(S)、西(E)、北(N)四個方向不同距離種子漂移率
Fig.2The seed frequency of transgenic Cry1Ac cotton GK19 in different direction and distance

2.2　外源基因Cry1Ac漂移Logisitc回歸預(yù)測

建立的用距離和方向預(yù)測SGK321、GK19種子的外源基因漂移四個Logistic回歸模型的參數(shù)及其顯著性檢測。表1

研究表明，從種子外源基因漂移來看，方向?qū)GK321種子的外源基因漂移有顯著影響，向東方、南方、西方的漂移顯著多于向北方的漂移，向東方、南方、西方漂移的優(yōu)勢分別是向北方漂移的2.301、2.813、5.068倍。距離對SGK321種子的外源基因漂移有顯著影響，同一方向上距離每增加1 m，漂移優(yōu)勢下降為1 m前漂移優(yōu)勢的0.991倍。

方向?qū)K19種子的外源基因漂移有顯著影響，向南方、西方的漂移顯著多于向北方的漂移，向南方、西方漂移的優(yōu)勢分別是向北方漂移的1.832、3.078倍。距離對GK19種子的外源基因漂移有顯著影響，同一方向上距離每增加1 m，漂移優(yōu)勢下降為1 m前漂移優(yōu)勢的0.996倍。

兩個模型的Nagelkerke決定系數(shù)都很小，小于0.03，說明兩個模型的擬合很不理想。兩個模型的Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢測，Logistic回歸預(yù)測模型的擬合優(yōu)度較差(P﹤0.05)，說明基因漂移的觀察結(jié)果和模型擬合結(jié)果差異較大。表明影響外源基因漂移的因子，并不是距離和方向共同作用的。表1

3　討 論

研究表明，在自然條件下，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉SGK321和GK19的外源基因Cry1Ac可以從這兩種棉花的小區(qū)向周圍的常規(guī)棉花漂移，使周圍常規(guī)棉花產(chǎn)生含有Cry1Ac基因的種子。這與國內(nèi)外相關(guān)報道的研究結(jié)果一致，只是各地得到的漂移距離不同。沈法富等[15](2001)認(rèn)為Bt基因流最遠(yuǎn)可達(dá)72 m，王長永[16]等(2007)、賀娟[17]等(2013)、張寶紅等[18]、連麗君等[19]認(rèn)為轉(zhuǎn)基因棉的花粉最遠(yuǎn)的傳播距離分別為25、36、50、100 m。Heuberger等[20]和Van Deynze等[21]分別證實在750 m 和1 625 m 處可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉的外源基因Cry1Ac。研究表明棉花種子的漂移率，在距離轉(zhuǎn)基因棉花小區(qū)邊緣1～120 m均能檢測到含有外源基因Cry1Ac。

不同的研究者得出的外源基因漂移距離不同的原因主要是研究方法差異較大。雖然棉花自身的傳播距離十分有限，但如果借助昆蟲和風(fēng)力的傳播就可使得漂移距離明顯提高。賀娟等[17](2013)利用溫室內(nèi)人工創(chuàng)造風(fēng)力和釋放傳粉昆蟲蜜蜂的條件下研究了外源基因Cry1Ac漂移的距離。研究表明，風(fēng)力處理的樣本，外源基因最遠(yuǎn)漂移距離為25.6 m，蜜蜂處理的最遠(yuǎn)漂移距離為36 m。朱家林等(2013)在溫室中創(chuàng)造人工定向風(fēng)和非定向風(fēng)條件研究了轉(zhuǎn)基因棉花外源基因Cry1Ac漂移率，結(jié)果表明，在定向風(fēng)處理中外源基因漂移率最遠(yuǎn)距離為25.6 m，非定向風(fēng)處理中外源基因漂移率最遠(yuǎn)距離為36 m。Heuberger[20], Van Deynze[13], Llewellyn[21],Smith[22]均認(rèn)為訪花昆蟲，如蜜蜂等對外源基因的漂移影響顯著。Richards(2005)[23]認(rèn)為昆蟲攜帶的花粉可以使得，依靠昆蟲傳粉的棉花的基因漂移率具有一定的波動性。王長永[16](2007)在自然條件下，利用花粉粒染色法研究了Bt外源基因漂移率，結(jié)果表明，外源基因最遠(yuǎn)漂移距離為25 m。Van Deynze(2005)年在自然條件下對轉(zhuǎn)基因抗除草劑基因漂移進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)外源基因最遠(yuǎn)漂移距離為1 625 m。

影響轉(zhuǎn)基因棉花漂移率的因素較多。研究由于條件限制沒有記錄氣候因子，比如風(fēng)、溫度、光照等因子，導(dǎo)致試驗結(jié)果沒能夠反應(yīng)出氣候因子對外源基因漂移帶來的影響。記錄氣候因子，同時合理的利用統(tǒng)計的方法研究自然條件下轉(zhuǎn)基因棉花的漂移率顯得更為準(zhǔn)確和合理。另外，檢測方法的靈敏度也會影響雜交后代的轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果。試驗由于檢測樣本數(shù)量太大，苗期通過卡那霉素的涂抹初步的鑒定了部分棉苗，隨后的棉花材料進(jìn)行分子析檢測。卡那霉素的檢測并不是完全可靠的，可能會漏掉部分陽性基因。因此，所有的檢測均應(yīng)該通過卡那霉素檢測結(jié)合PCR檢測更能準(zhǔn)確的檢測外源基因漂移。另外，研究對于傳粉昆蟲的背景研究較少，棉花花期傳粉昆蟲的種類以及昆蟲是否會隨風(fēng)遷移等問題仍不清楚。

基因漂移是自然界客觀存在的事實，影響轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移的因素非常復(fù)雜，風(fēng)向、傳粉昆蟲，都是不可忽視的重要因子，需要綜合考慮多因子對外源基因漂移帶來的影響。因此，準(zhǔn)確的研究特定的轉(zhuǎn)基因植物基因流監(jiān)測, 需根據(jù)具體目標(biāo)、監(jiān)測要求以及資源情況, 選用一種或綜合使用幾種方法進(jìn)行監(jiān)測。

4　結(jié) 論

研究表明在距離轉(zhuǎn)基因棉花小區(qū)邊緣1～120 m均能檢測到含有外源基因Cry1Ac。SGK321種子漂移率最大漂移率是向南方向距離轉(zhuǎn)基因棉花小區(qū)邊緣1 m處，漂移率為5%；GK19最大漂移率是向西方向達(dá)到了10.09%。以方向因素和距離因素建立Cry1Ac基因漂移Logistic回歸預(yù)測模型，方向和距離對種子外源基因漂移有一定影響，但影響外源基因漂移的因子并不是方向和距離聯(lián)合決定的，用這兩個因子并不能準(zhǔn)確的預(yù)測外源基因漂移率。

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