抗生素在基因工程藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用

周偉，范杰，楊玉紅，夏煥章，闞國仕，徐艷，陳紅漫，王媛媛

摘要：基因工程藥物在目前醫(yī)藥市場(chǎng)所占的比例越來越大。在基因工程藥物生產(chǎn)的過程中，抗生素在某些環(huán)節(jié)起到了不可或缺的作用。本文就抗生素在基因工程藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)。

關(guān)鍵詞：抗生素；基因工程藥物；工程細(xì)胞

基金項(xiàng)目：2016年沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)項(xiàng)目“《生物技術(shù)制藥》跨校修讀學(xué)分課程教學(xué)模式的研究與實(shí)踐”（ 2016-189），“生物工程專業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育與學(xué)生綜合素質(zhì)提升的研究與實(shí)踐”（2016-161）；遼寧省教育廳“省級(jí)工程人才培養(yǎng)模式改革試點(diǎn)專業(yè)——生物工程”，GZ201340

中圖分類號(hào)： R915 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.04.046

自20世紀(jì)80年代以來，現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是分子克隆、基因重組以及生物工程和細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)等關(guān)鍵技術(shù)的突飛猛進(jìn)，已經(jīng)有越來越多的生物技術(shù)藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用，成為防病、治病藥物的一個(gè)重要部分。當(dāng)前生物技術(shù)藥物正趕超傳統(tǒng)化學(xué)制藥，逐漸成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所依靠的重要藥物來源，是當(dāng)今最活躍和發(fā)展最迅速的領(lǐng)域。據(jù)1998年美國藥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，美國FDA已批準(zhǔn)了56種生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品上市，其中絕大多數(shù)為基因工程藥物。此外，還有200多種基因工程藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其中至少有1/5的產(chǎn)品將可能在今后十年內(nèi)上市[1]。

基因工程藥物主要是指利用重組DNA技術(shù)，將生物體內(nèi)生理活性物質(zhì)的基因在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中大量表達(dá)生產(chǎn)的新型藥物。基因工程藥物生產(chǎn)的基本流程是：將目的基因用DNA重組的方法連接在載體上，然后將載體導(dǎo)入靶細(xì)胞（微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人體組織靶細(xì)胞），使目的基因在靶細(xì)胞中得到表達(dá)，最后將表達(dá)的目的蛋白質(zhì)提純及做成制劑，從而成為基因工程類藥物苗。在基因工程藥物研究和生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)中，抗生素發(fā)揮了不可替代的作用。本文以基因工程藥物研發(fā)和生產(chǎn)的流程為線索，探討抗生素在基因工程藥物生產(chǎn)中的作用。

1 基因工程菌的構(gòu)建

1.1 宿主細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)

基因工程中基因高效表達(dá)是指外源基因在某種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄、翻譯、所有加工過程和表達(dá)活動(dòng)。在外源基因表達(dá)的過程中宿主菌的選擇事關(guān)重要，根據(jù)國家藥典（2015版）規(guī)定，常用的宿主細(xì)胞主要由有兩大類，第一類為原核細(xì)胞（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）；第二類為真核細(xì)胞（酵母、絲狀真菌等）[2]。作為宿主，勿庸置疑會(huì)對(duì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響。每一個(gè)宿主細(xì)胞都像一個(gè)微觀的小工廠，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務(wù)”。為了解決細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的污染問題，宿主細(xì)胞本身可以具有選擇標(biāo)記，常用的方法如抗生素標(biāo)記等。但需要注意的是，為了構(gòu)建工程菌株過程中的篩選過程，要求宿主細(xì)胞與載體所攜帶的抗性標(biāo)種類不同，便于后期雙抗培養(yǎng)基的配置及陽性克隆的篩選[3]。

1.2 載體中抗性篩選標(biāo)記

載體是指在基因工程重組DNA技術(shù)中將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。基因工程中用于選擇的篩選標(biāo)記一般在載體上，在基因工程意義上來說，它是重組DNA載體的重要標(biāo)記，合適的篩選標(biāo)記基因及其相應(yīng)的篩選劑是轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵，供重組DNA的鑒定和選擇[4]。

標(biāo)記基因種類多種多樣，主要包括抗性基因、顏色反應(yīng)基因、代謝缺陷型互補(bǔ)基因和一些其他具有明顯性狀表型有關(guān)的基因。其中抗性基因，尤其抗生素標(biāo)記基因（如抗卡那霉素基因、抗氨芐青霉素基因、抗新霉素基因），因抗生素分子更小、反應(yīng)更靈敏的特點(diǎn)是目前最普遍使用的標(biāo)記基因[5]。例如以基因克隆中普遍使用的載體pBR322為例，該載體含有兩種抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因：氨芐青霉素抗性基因（AmpR）和四環(huán)素抗性基因（TetR），TetR基因內(nèi)部含有限制酶等酶切位點(diǎn)。將外源DNA分子和載體構(gòu)建為重組子，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞后，接種至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基。經(jīng)過培養(yǎng)，含有載體的大腸桿菌因具有抗氨芐青霉素的表型，在培養(yǎng)基上可形成菌落，而不含有載體的大腸桿菌則不能生長。

2 基因工程細(xì)胞（菌株）的發(fā)酵過程

目的基因經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)入受體細(xì)胞后，需經(jīng)過一系列篩選和擴(kuò)增，獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)的目的蛋白的工程細(xì)胞（菌）株。進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，也是外源基因高效表達(dá)目的蛋白的過程。工程細(xì)胞（菌）株大規(guī)模培養(yǎng)的基本條件和優(yōu)化設(shè)計(jì)及控制中添加適當(dāng)種類和濃度的抗生素對(duì)外源基因的高效表達(dá)至關(guān)重要。

2.1 培養(yǎng)工程細(xì)胞（菌株）的器皿消毒

細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵之一是防止微生物的污染。這里除了操作者必須具有很強(qiáng)的無菌觀念、嚴(yán)格按照無菌規(guī)程進(jìn)行操作之外，所有培養(yǎng)用的器材和液體都必須進(jìn)行嚴(yán)格的消毒滅菌處理[5]。除了物理消毒法外，常常會(huì)用到抗生素對(duì)各種培養(yǎng)器皿進(jìn)行消毒。常用到的抗生素包括青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等，但各種抗生素的用量差別很大。

2.2 工程細(xì)胞（菌株）發(fā)酵液中添加抗生素

在工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵工程細(xì)胞的過程中，往往會(huì)在發(fā)酵液中有目的地加入抗生素，其原因如下：

保證基因工程菌的穩(wěn)定性：基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。在提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法中的選擇壓力法，就是在培養(yǎng)基中加入抗生素，它也是工程菌培養(yǎng)中提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的常用方法[6]。含有抗藥性基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，基因工程菌就獲得了抗藥性。發(fā)酵時(shí)在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素可以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，消除重組質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的影響，從而提高發(fā)酵生產(chǎn)率。

協(xié)助形成細(xì)胞壁缺陷：在培養(yǎng)基中加入青霉素、甘氨酸或絲裂霉素 C 等因子，便可破壞或抑制細(xì)胞壁中肽聚糖的結(jié)構(gòu)或其合成受到抑制，但還不至于造成細(xì)菌死亡，細(xì)胞壁有缺陷的細(xì)胞，對(duì)滲透壓敏感，容易破裂，為胞內(nèi)代謝目的產(chǎn)物的分離純化提供了便利條件。

防止培養(yǎng)過程中出現(xiàn)其他雜菌污染：抗生素可以通過影響雜菌細(xì)胞壁合成（青霉素類和頭孢菌素類）、影響雜菌細(xì)胞膜滲透性（多粘菌素和短桿菌素）、干擾蛋白質(zhì)的合成（福霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素）、抑制核酸的轉(zhuǎn)錄（萘啶酸和二氯基吖啶）等方式抑制雜菌的出現(xiàn)。需要注意的是，在某些生產(chǎn)過程中即使存在雜菌污染，也不需要添加抗生素。因?yàn)楫?dāng)微生物制藥過程中微生物的數(shù)量的增加及代謝物的積累，形成的環(huán)境已經(jīng)不再適合其他微生物的生長，會(huì)主動(dòng)抑制雜菌。

3 合理使用抗生素

過度使用抗生素的危害是多方面的，對(duì)細(xì)菌來說，會(huì)產(chǎn)生耐藥性，也就是說過多的使用抗生素會(huì)使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生抵抗力，從而使抗生素的抗菌作用減弱或消失[7]。抗生素使用過多是否對(duì)我們所需要的藥物有一定影響？對(duì)基因工程藥物的合成、制備和分離是否有影響？以上問題都是未知的。除此之外，抗生素引發(fā)的毒性反應(yīng)更不可忽視，因此，在基因工程藥物生產(chǎn)過程中合理利用抗生素，規(guī)避使用抗生素帶來的一些問題，也是我們將來的研究方向。

參考文獻(xiàn)

[1]郭行彥.基因工程藥物的分離與純化方法[J].國外醫(yī)學(xué)：抗生素分冊(cè)，1994（07）：261-267.

[2]國家藥典委員會(huì).中國人民共和國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015.

[3]匡光偉，孫志良，陳小軍，等.四環(huán)素類抗菌藥物的降解研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（05）：1744-1788.

[4]朱保泉，生物制藥技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：46-102.

[5]夏煥章，熊宗貴，等.生物技術(shù)制藥[M].高等教育出版社，2006：140-162.

[6]陳兆坤，胡昌勤，等.頭抱菌素類抗生素的降解機(jī)制[J].國外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè)，2004，25（06）：219-265.

[7]崔浩.抗生素的細(xì)菌耐藥性：酶降解和修飾[J].國外醫(yī)藥：藥學(xué)分冊(cè)，2006，33（01）：34-36.

作者簡介：周偉，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)制藥。

通訊作者：王媛媛，博士，講師，研究方向：生物工程的教學(xué)和科研。