不同貯藏溫度下鱸魚腐敗菌生長動力學與貨架期預測

藍蔚青　張皖君　段賢源　吳啟月　盧　瑛　謝　晶

(1.上海海洋大學食品學院， 上海 201306； 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心， 上海 201306)

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)

0　引言

鱸魚(Lateolabraxjaponicus)為鱸形目真鱸科花鱸屬經濟魚類，其肉質白嫩，營養豐富。由于魚肉中的水分和蛋白質含量高，組織脆弱，極易受微生物生長的影響而發生腐敗變質。鮮魚流通期間，在腐敗過程中逐漸占據優勢、并產生異味代謝產物的小部分微生物，被稱為該產品的特定腐敗菌(Specific spoilage organism，SSO)[1-2]。SSO生長變化與魚肉腐敗速度密切相關，因此建立與鱸魚品質高度相關的腐敗菌生長動力學模型，預測其貯藏貨架期，是預防魚肉腐敗變質的可靠而迅速的手段之一[3]。

低溫保鮮可降低水產品中微生物的增殖速率，是淡水魚最常用的貯存和保鮮方法，利用不同低溫保鮮方式模擬溫度對水產品品質及微生物生長變化的影響更契合實際。目前，一級模型中修正的Gompertz方程和Logistic方程在微生物動力學研究中應用較廣泛，二級模型用于表達不同環境因素(如pH值、溫度、水分活度等)對微生物增殖的影響。溫度是影響魚肉腐敗菌生長的最重要因子，常用Belehradek方程與Arrhenius方程描述其與微生物動力學參數的最大比生長速率(k)和延滯時間(λ)的關系[4-5]。不同研究對象描述其腐敗程度的模型存在差異，POWELL等[6]研究表明，Belehradek平方根方程能較好擬合0～10℃溫度下氣調包裝大西洋鮭魚中特定腐敗菌的生長情況。LIU等[7]研究得出，Arrhenius方程對反映不同溫度下虹鱒魚片中菌落總數變化特點的擬合效果極佳，并能對0～9℃虹鱒魚片的貯藏品質與剩余貨架期進行更精準的預測。在生產流通中，受操作環境的影響，水產品在流通期間也會發生溫度波動，對其品質造成嚴重影響。章志超等[8]模擬鱘魚的斷鏈流通溫度，并以8℃和波動溫度對模型進行驗證，探究不同溫度下鱘魚中熒光假單胞菌的生長模型。劉壽春等[9]通過對比分析4℃恒溫和0～4℃溫度波動貯藏過程中冷卻豬肉感官、理化和微生物特征的變化，表明溫度波動對豬肉品質劣變速率和貨架期均有不同程度的影響。

為將微生物生長預測模型應用到實際生產中，本文采用不同冰藏和冷藏方式模擬鱸魚的實際流通環境，建立-1.8～10 ℃范圍內的特定腐敗菌生長動力學模型及貨架期預測模型，并同時采用碎冰貯藏(0℃)與溫度波動條件對預測模型的適用性進行驗證，以期為快速預測鱸魚在流通過程中的品質與貨架期提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　原料處理

鮮活鱸魚(Lateolabraxjaponicus)60條，質量為(500±20)g，購自上海市浦東新區工商超市，挑選個體均一魚樣，30 min內運往實驗室進行實驗。

將鮮鱸魚放入盛滿碎冰的泡沫箱中，使其窒息死亡，經去頭去尾去內臟處理，用蒸餾水清洗、瀝干后裝入自封袋中，分成5組。為貼近實際生產應用，實驗模擬了鮮鱸魚的不同流通條件，具體如圖1所示(圖中n表示所用鱸魚樣品條數)。

圖1　實驗設計流程圖Fig.1　Flowchart of experimental design

其中，模擬流通組鱸魚在捕獲后先經流化冰預冷(-1.8℃)4 h，后置于無冰泡沫箱中模擬運輸(0.8℃)8 h，當天到達超市后利用碎冰進行貯藏銷售(0℃)至23 d。取樣周期為流化冰處理組、碎冰處理組與模擬流通組(即波動溫度)每2 d測定1次，冷藏處理組與常溫處理組每天測定1次，各組指標至少重復3次。流化冰、碎冰處理組樣品置于冷藏柜中，根據需要及時更換補充冰，保持體系溫度恒定。采用數顯溫度記錄儀測定貯藏過程中冰箱溫度與魚肉溫度。流化冰由80%冰與20%水組成，鹽水質量濃度為3.3 g/mL，利用RE-1000W-SP型流化冰機制取冰漿。

1.2　主要藥品試劑

NaCl，中鹽長江鹽化有限公司；平板計數瓊脂(PCA)培養基、假單胞菌CFC選擇性培養基、含鐵瓊脂(IA)等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3　主要儀器設備

RE-1000W-SP型流化冰機，南通瑞友工貿有限公司；MLS-3750型滅菌鍋，日本SANYO公司；生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Testo-176T4型德圖電子溫度記錄儀，德國儀器國際貿易(上海)有限公司。

1.4　實驗方法

1.4.1微生物計數

細菌總數(TVC)、假單胞菌和希瓦氏菌數均參照文獻[10]測定。稱取10 g魚肉于滅菌袋中，加入90 mL 0.85%無菌生理鹽水，拍打均勻后以10倍梯度稀釋，根據不同貯藏時間，取3個合適的稀釋度，每個稀釋度取1 mL置于無菌培養皿內，每個稀釋度作3個平行。其中，PCA培養基測定TVC，在(30±1)℃下培養72 h計數。滅菌后的假單胞CFC選擇性培養基冷卻至50℃，加入假單胞菌CFC選擇性培養基添加劑，搖勻后倒入平板。IA培養基測定希瓦氏菌，其均在(30±1)℃下培養48 h計數。

1.4.2感官分析

參考朱志偉等[11]法，稍作修改，感官評價采用質量指標法(Quality index method，QIM)。由7名專業培訓的評定人員，隨機抽取不同時期的鱸魚魚肉樣品，對其光澤度、通透性、顏色、表面粘液、氣味與質地等方面進行分析，為確保實驗的一致性，所用魚片均取自魚體背部肌肉。QIM法中不同參數的分值范圍在0～3，其中0為最佳品質，3或每個參數的最高分代表最低品質，將各參數分值相加，得出最終質量指標(QI值)。

1.4.3總揮發性鹽基氮值

總揮發性鹽基氮值(TVB-N)含量參照文獻[12]測定。

1.4.4特定腐敗菌生長動力學模型的建立

利用修正的Gompertz模型[13]描述不同溫度下鱸魚特定腐敗菌的生長動態，公式為

lgN(t)=lgN0+lg(Nmax/N0)·
exp(-exp(2.718k/lg(Nmax/N0)(λ-t)+1))

(1)

式中t——時間，h

N(t)——t時菌數，CFU/g

Nmax——最大菌數，CFU/g

N0——初始菌數，CFU/g

k——微生物生長的最大比生長速率，h-1

λ——微生物生長的延滯時間，h

二級模型主要描述溫度與微生物生長動力學參數(k和λ)的關系。采用Belehradek平方根方程[14]、Arrhenius方程[15]描述溫度對微生物最大比生長速率k和延滯期λ的影響。Belehradek方程為

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)

(2)

k1/2=bk(T-Tmink)

(3)

式中b——常數T——溫度，K

Tmin——假設的概念，指最大比生長速率為零時的溫度

Arrhenius方程為

lnk=lnk0-Eak[1/(RT)-1/(RTref)]
ln(1/λ)=ln(1/λ0)-Eaλ[1/(RT)-1/(RTref)]

(4)

式中R——通用氣體常數，J/(mol·K)

Tref——基準溫度，取273 K

k0——Tref時的最大比生長速率，h-1

λ0——Tref時的延滯時間，h

Eak——k的活化能，kJ/mol

Eaλ——λ的活化能，kJ/mol

1.4.5生長預測模型的可靠性評價

采用偏差度Bf和準確度Af來評價已建立的微生物生長動力學預測模型可靠性，Bf、Af為1.0，表示模型預測值與實測值完全吻合。偏差度和準確度公式為

(5)

(6)

式中NMV——實測特定腐敗菌數量

NPV——同一時間由微生物生長動力學模型得到的腐敗菌數量預測值

n——重復次數

1.4.6鱸魚貨架期預測與評價

根據已建立的-1.8～10℃溫度范圍內特定腐敗菌的生長動態模型，由鱸魚特定腐敗菌從初始菌數增至感官拒絕點時最小腐敗菌數的時間進行貨架期預測。將碎冰處理組與模擬流通組的鱸魚貨架期實測值與模型預測值進行比較，通過相對誤差評價預測模型的準確性。

2　結果與分析

2.1　優勢腐敗菌數與最小腐敗量確定

為準確預測鮮鱸魚的貨架壽命，需確定鱸魚的SSO數量與最小腐敗量Ns，即魚肉鮮度在感官拒絕時的特定腐敗菌數[16]。其中，圖2是采用修正的Gompertz方程回歸分析得到不同貯藏溫度下鱸魚的菌落總數、希瓦氏菌數和假單胞菌數生長規律。

圖2　鱸魚在不同貯藏溫度下希瓦氏菌數、假單胞菌數和細菌總數的變化Fig.2　Changes of Shewanella, Pseudomonas and TVC growth of Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

由圖2可見，新鮮鱸魚貯藏初期的微生物數量雖不多，但隨著貯藏時間的延長，其希瓦氏菌、假單胞菌數逐漸接近總菌數，成為優勢菌。王慧敏等[17]研究確定鱸魚在微凍與冷藏下的主要優勢腐敗菌是希瓦氏菌和假單胞菌。由表1得出，鱸魚4種溫度下貨架期終點(即感官拒絕點)時的QI值集中在9～10，此時魚肉氣味和質地已不符合消費者食用要求。TVB-N質量比為(20.45±3.77) mg/(100 g)，達到文獻[18]的衛生標準，說明當微生物數超過上述數量級時，魚樣可能已腐敗。因此，可認定希瓦氏菌、假單胞菌的最小腐敗量Ns為(6.48±0.41) lg CFU/g與(6.33±0.36) lg CFU/g，根據希瓦氏菌與假單胞菌的生長規律可預測鱸魚的貯藏貨架期。

表1　不同貯藏溫度下鱸魚初始及貨架期終點時的SSO數、TVB-N質量比和QI值Tab.1　SSO counts, TVB-N and QI values at beginning and end of storage time in Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

2.2　鱸魚特定腐敗菌的生長曲線

圖3為在模擬鱸魚4種流通溫度(-1.8、0、4、10℃)下得到的假單胞菌及希瓦氏菌生長實測值，通過采用修正的Gompertz方程對微生物生長曲線進行擬合。

由表2可知，擬合的決定系數R2較高，均大于0.93，生長曲線都呈現出典型“S”型特征，說明修正的Gompertz方程能準確描述不同溫度下假單胞菌和希瓦氏菌隨時間的變化規律。張新林等[19]在三文魚熒光假單胞菌的研究中也有類似結論。兩種腐敗菌的初始菌數在3～4 lg CFU/g，表明樣品新鮮，符合實驗預期值，穩定期的最大菌數在6.34～8.30 lg CFU/g。-1.8℃的假單胞菌、希瓦氏菌最大比生長速率k為0.012 6、0.011 9 h-1，延滯期λ分別為217.20、269.28 h。隨著溫度的升高，兩種菌的最大比生長速率逐漸增大，延滯期縮短，表明溫度對特定腐敗菌的生長有較大影響[5]。低溫降低了微生物體內酶的活性，抑制其生長速率，延長增殖適應期，說明流化冰的微凍處理對鱸魚腐敗菌生長有明顯抑制作用。

圖3　不同貯藏溫度下鱸魚肉中假單胞菌、希瓦氏菌的生長曲線Fig.3　Growth curves of Pseudomonas and Shewanella in Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

微生物種類貯藏條件溫度/℃R2λ/hk/h-1Nmax/(lgCFU·g-1)流化冰-1.80.9758217.200.01266.34假單胞菌碎冰00.9605201.120.01737.46冷藏140.9724102.480.02238.09冷藏2100.978648.000.04978.05流化冰-1.80.9325269.280.01196.76希瓦氏菌碎冰00.9576143.520.01117.49冷藏140.9669118.800.02048.30冷藏2100.983764.560.05647.41

圖4　Belehradek方程中溫度對特定腐敗菌最大比生長速率(k)、延滯期(λ)的影響Fig.4　Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of SSO with Belehradek equation

2.3　溫度對微生物生長動力學參數的影響

應用二級模型Belehradek 方程和Arrhenius方程描述溫度T與Gompertz方程所得的特定腐敗菌最大比生長速率k和延滯期λ的關系。

從圖4可知，Belehradek方程對兩種特定腐敗菌的k、λ決定系數均大于0.90，表現出良好的線性關系，說明Belehradek 方程能很好描述溫度對微生物k和λ的影響，反映鱸魚優勢腐敗菌隨溫度變化而呈現出的規律。國內相關人員[8, 20]研究假單胞菌在草魚、鱘魚等的生長數據也得到類似結論。

溫度T與鱸魚假單胞菌最大比生長速率k和延滯期λ的Belehradek方程為

k1/2=0.008 9T+0.127 0
(1/λ)1/2=0.006 6T+0.075 5

T與希瓦氏菌k和λ的Belehradek方程為

k1/2=0.011 2T+0.115
(1/λ)1/2=0.004 9T+0.075 6

由圖5可知，Arrhenius方程除對希瓦氏菌λ的擬合度(R2>0.877 6)較小外，其余R2均較大(R2>0.92)。

圖5　Arrhenius方程中溫度對特定腐敗菌最大比生長速率(k)、延滯期(λ)的影響Fig.5　Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of SSO with Arrhenius equation

其中，溫度與鱸魚假單胞菌k和λ的Arrhenius方程為

lnk=-8 326.19/T+26.35
ln(1/λ)=-9 958.75/T+31.28

T與希瓦氏菌k和λ的Arrhenius方程為

lnk=-10 444.35/T+33.91
ln(1/λ)=-8 091.00/T+24.43

2.4　微生物生長預測模型的建立與可靠性評價

為使建立的模型更具實用性與可靠性，結合鱸魚實際流通環境，本實驗以碎冰貯藏(0℃)和波動溫度條件下的特定腐敗菌實測值驗證生長預測模型的準確性。ROSS[21]曾提出Bf值的劃分標準：0.901.15，模型為不可接受。Af值越小(大于1)，模型預測的準確性越高。

由表3可知，0℃和波動溫度下基于Belehradek方程得出的假單胞菌、希瓦氏菌生長預測模型的Bf分別為0.951 0、0.993 6和0.982 1、1.024 2，處于模型最佳范圍，Af分別為1.042 5、1.084 5和1.093 4、1.107 5，模型的預測誤差絕對值在4.25%～10.75%，表明建立的模型能很好預測鱸魚特定腐敗菌在0℃和波動溫度下的生長規律。而基于Arrhenius方程所得的假單胞菌、希瓦氏菌的預測模型的Bf處于模型可接受范圍，預測誤差絕對值在9.55%～21.66%，因此，基于Belehradek方程的生長預測模型對腐敗菌的預測效果更好。

表3　波動溫度條件下特定腐敗菌生長模型預測的偏差度和準確度Tab.3　Bias and accuracy factors from different models of growth value of SSO under non-isothermal conditions

2.5　鱸魚剩余貨架期模型建立與評價

由表1已知假單胞菌、希瓦氏菌的初始菌數(N0)和最小腐敗值(Ns)，利用修正的Gompertz方程結合2.3節的溫度T與最大比生長速率k和延滯期λ的Belehradek方程得出鱸魚在-1.8～10℃下的貨架期預測模型

(7)

(8)

同理，結合2.3節的溫度T與k和λ的Arrhenius方程得出鱸魚在-1.8～10℃下的貨架期預測模型

(9)

(10)

表4是鱸魚特定腐敗菌在0℃和波動溫度條件下預測值和實際值比較，其中由Belehradek方程得到的貨架期預測模型對假單胞菌、希瓦氏菌的預測相對誤差為-4.96%、-8.81%和-7.30%、-5.02%，絕對值在0～10%范圍內，表明預測模型準確度較好。由Arrhenius方程得到的貨架期預測模型對假單胞菌、希瓦氏菌的預測相對誤差較大，其中希瓦氏菌達19.37%，說明由Belehradek方程所得貨架期模型預測效果更佳。

表4　波動溫度條件下貨架期預測模型的驗證Tab.4　Validation of shelf life prediction models under non-isothermal conditions

3　結論

(1)修正的Gompertz方程能較好描述-1.8～10℃下鱸魚假單胞菌和希瓦氏菌的生長情況，擬合決定系數R2均達0.93以上。在Belehradek方程下，溫度與希瓦氏菌和假單胞菌最大比生率(k)和延滯期(λ)呈良好線性關系，R2均大于0.90，擬合效果優于Arrhenius方程，反映了低溫對特定腐敗菌生長的抑制效果。

(2)基于Belehradek方程所建鱸魚溫度模型在-1.8～10℃范圍內預測誤差較小，位于模型最佳范圍，且剩余貨架期預測模型的相對誤差絕對值在0～10%，比Arrhenius方程建立的生長預測模型和貨架期模型準確。

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