高效液相色譜法測定苜蓿中脫落酸的含量

(北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100094)

苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科草本植物，是世界上廣泛種植的豆科牧草之一，主要分布于地中海區域、非洲、西南亞和中亞地區。苜蓿因其高產、營養豐富且具有根瘤固氮[1,2]等優點，而被廣泛種植，被譽為“牧草之王”[3]。ABA是最早在對植物芽和種子休眠研究過程中發現的物質，其可作為植物抗旱能力重要的調節因子，ABA對于植物的細胞分裂與伸長、組織與器官分化、休眠與萌發、植物形態建成以及離體組織培養等方面具有重要作用[4,5]。通過分析ABA在植物體內分布的含量變化規律，研究其與抗逆能力的關系，將為合理、有效地配比外源激素，提高植物的抗逆性、培育出耐旱植物的新品種提供有力的理論依據[6]。因此建立快速準確的苜蓿中ABA的分析方法具有重要的應用意義和實用價值。

對于ABA的分析目前多采用生物鑒定法，免疫學方法，以及物理化學方法[7,8]。其中化學方法中的色譜法因其具有檢測方法專一，靈敏和準確高的特點，已成為植物激素檢測中常用的技術[9-11]。本實驗選取苜蓿根系樣品為研究對象，通過樣品前處理方法優化，HPLC分析方法學考察，建立了高效液相色譜測定苜蓿中脫落酸含量的方法，該方法具有快速、簡便、準確的優點，可以應用于植物中ABA含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；CR22G Ⅲ離心機(日本Hitachi公司)。

乙腈、石油醚(均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司；SPE專用柱管(購買自Agilent公司)；Sep-Pak C18柱(購買自Waters公司)； PVPP、ABA對照品(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 提取方法

取苜蓿根系樣品，液氮冷凍研磨，采用避光冷浸提取(冰箱4℃)的方法進行提取。分別對提取溶劑、提取時間、料液比、提取次數等條件進行優選，研究不同提取條件對ABA含量的影響，最終確定ABA最佳的提取方法。

1.2.2 凈化方法建立

采用自制PVPP柱和Sep-Pak C18柱聯用進一步對樣品進行處理。首先，稱取PVPP0.5g，填入SPE專用柱管，并與活化后的Sep-Pak C18柱串聯。加入提取后樣品，待樣品完全通過PVPP柱和SPE柱，拆下PVPP柱，并對SPE柱進行清洗、洗脫，得到ABA凈化后樣品。

1.3 分析方法

1.3.1 HPLC色譜條件

色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)；CH3OH∶1%乙酸水溶液=35∶65等度洗脫；檢測波長254 nm，進樣量20 μL，流速0.4 mL/min，柱溫35℃。

1.3.2 線性范圍和檢出限

稱取ABA對照品25 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得1.0 mg/mL ABA對照品溶液。從其中分別吸取5.0、2.5、1.0、0.5 mL置于4個10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，則濃度依次為0.5、0.25、0.1、0.05mg/mL。分別對上述對照品溶液進行HPLC分析，繪制標準曲線。其中，對0.05 mg/mL ABA對照品溶液用逐級稀釋的方式獲得檢出限和定量限，以信噪比(S /N≥3)的檢測量為檢出限，以信噪比(S/N≥10)的檢測量為定量限。

1.3.3 穩定性

取1.0 mg/mL ABA對照品溶液，分別在0、12、24、36、48h進行HPLC分析。測定峰面積積分值，考察ABA溶液的穩定性。

1.3.4 精密度

取1.0 mg/mL ABA對照品溶液，重復進行HPLC分析6次。測定峰面積積分值，考察方法精密度。

1.3.5 重復性

取同一種樣品按照1.2優化后的前處理方法平行提取6份，分別進行HPLC分析。測定峰面積積分值，考察方法重復性。

1.3.6 加標回收率

對已知含量的同一樣品分別添加3種不同質量濃度的ABA對照品，每個濃度水平樣品重復3次，按照1.2優化后的前處理方法進行提取，并進行ABA含量測定，考察加標回收率。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法

2.1.1 提取溶劑

稱取液氮研磨后苜蓿根系樣品1.0 g，按料液比1∶10 g/mL分別加入冷卻的甲醇、乙腈、水、80%甲醇、50%甲醇溶液(以上溶液均內含10 μg/L的抗氧化劑BHT)，放置4℃冰箱提取24 h，浸提液以10000 r/min離心15 min得上清液，于35 ℃減壓濃縮至原體積1/3。用1 mol/L Na2HPO4調節至pH=8，加入等體積石油醚萃取脫色3次，棄去石油醚相后，加入0.1 g PVPP，常溫下搖床振蕩30 min，10000 r/min離心15 min棄去PVPP，濾液用2 mo1/L檸檬酸調節至pH=3，再用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，于35℃減壓濃縮至干。所得殘留物加入3 mL pH 3.5磷酸鹽緩沖液溶解，過Sep-Pak C18預處理小柱進一步純化ABA(依次為5 mL甲醇清洗，5 mL磷酸鹽平衡，3 mL樣品上樣，5 mL 20%甲醇清洗，5 mL 80%甲醇洗脫)。其中，80%甲醇洗脫液在40 ℃濃縮至干，用流動相溶解至1 mL，溶液經0.45 μm微孔濾膜過濾后，進行HPLC分析。每個樣品平行提取3次，結果表明80%甲醇作為提取溶劑時，ABA的提取率最高(表1)。

表1 提取溶劑優化試驗

2.1.2 提取時間

80%甲醇作為提取溶劑，設定提取時間分別為4 h、8 h、16 h、24 h，其余條件同2.1.1，結果見表2，當提取時間為16 h和24 h時，ABA的提取率基本相同。故選取提取時間為16 h為單因素最佳條件(表2)。

表2 提取時間優化試驗

2.1.3 料液比

80%甲醇作為提取溶劑，提取時間16 h，設定料液比分別為1∶5 g/mL、1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL，其余條件同2.1.1，結果見表3。在料液比達到1∶20 g/mL之前，提取率隨提取液用量的增加而增加，當料液比繼續增大時，提取率基本保持不變。為了減少樣品后續減壓濃縮的時間，故選取料液比為1∶20 g/mL為單因素最佳條件(表3)。

表3 料液比優化試驗

2.1.4 提取次數的確定

選擇80%甲醇作為提取溶劑，提取時間16 h，料液比為1∶20 g/mL，提取次數分別為1次、2次、3次，其余條件同2.1.1，結果見表4。隨著提取次數增多ABA提取率提高，但提取次數達到3次時提取率呈下降的趨勢，一方面可能由于提取次數增多，導致其他雜質的溶出，從而干擾了ABA的提取，另一方面，可能為提取時間過長，導致ABA不穩定降解，故選取提取次數2次為最佳條件。綜上，ABA最佳的提取條件為：提取溶劑為80%甲醇，提取時間16 h，料液比為1∶20 g/mL，提取2次(表4)。

表4 提取次數優化試驗

2.1.5 凈化方法建立

基于PVPP對多酚類雜質吸附的特性和SPE對ABA良好的富集性，建立了PVPP和SPE聯用方法。通過在SPE專用柱管中裝填PVPP后與Sep-Pak C18柱串聯，對提取后樣品采用磷酸鹽緩沖液溶解后上柱凈化，一步完成去除多酚和ABA富集工作，大大縮短了樣品的凈化時間。

2.2 樣品分析方法

2.2.1 線性范圍和檢出限

以ABA對照品濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y= 226595.4X+1064.4，相關系數為0.9991。結果表明，ABA在0.05～1 mg/L范圍內線性關系良好。用逐級稀釋的方式獲得ABA的檢出限和定量限，其中檢出限為0.02μg/g和定量限為0.04μg/g，(圖1)。

圖1 ABA對照品標準曲線

2.2.2 穩定性

通過對不同時間點的ABA對照品溶液進行HPLC分析，測定峰面積積分值。ABA對照品峰面積積分值的RSD為2.40%，結果表明ABA在48 h內穩定性良好。

2.2.3 精密度

通過對ABA對照品溶液重復進行HPLC分析，測定峰面積積分值。ABA對照品峰面積積分值的RSD為0.97%，結果表明該方法精密度良好。

2.2.4 重復性

通過對同一種樣品進行平行提取，分別進行HPLC分析，測定峰面積積分值。樣品中ABA峰面積積分值的RSD為3.42%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.5 加標回收率

加標回收率試驗結果見表5。低、中、高3種水平ABA溶液的加標回收率分別是91.7%、93.8%、105.2%，RSD 分別為3.85%、2.94%和2.58%，結果見表5。

表5 ABA回收率試驗結果(n=3)

2.3 苜蓿中脫落酸含量測定

采用上述建立的前處理和分析方法，分別對中苜1號、費納爾、敖漢苜蓿的根系樣品開展ABA含量的檢測。結果見表6、圖2。

表6 苜蓿中脫落酸含量測定

圖2 苜蓿中脫落酸含量測定HPLC色譜圖A.中苜1號；B.費納爾；C.敖漢

3 結論

經樣品前處理方法優化，確定ABA最佳的提取條件為：提取溶劑80%甲醇(內含10 μg/L的抗氧化劑BHT)，提取時間16 h，料液比為1∶20 g/mL，提取2次。同時，采用自制PVPP柱的方式，建立了PVPP吸附和SPE聯用方法，減少了前處理時間。并對HPLC分析方法進行考察，結果顯示ABA在0.05～1 mg/L范圍內線性關系良好，檢出限為0.02μg/g，定量限為0.04μg/g。該方法穩定性、精密度、重現性良好，加標回收率為91.7～105.2%。經實際樣品檢測，所建立的方法具有快速、簡便、準確的優點，可以廣泛應用于植物中ABA含量的測定。

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