液相色譜法測定乳飲料中阿司帕坦含量的不確定度分析

嘉琦

(北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京市科學技術研究院分析測試技術重點實驗室，北京 100089)

測量不確定度描述了測量結果的可疑程度，是表征被測定值的分散性的參數[1,2]，其數值的大小反映了測量結果質量的高低，并直接與檢驗結果的合格判定相關。《實驗室資質認定評審準則》中規定：在不確定度與檢測結果的有效性或應用有關，或客戶有要求，或不確定度影響到對結果符合性的判定時，檢測報告必須包括不確定度的信息[3]。阿司帕坦即天門冬酰苯丙胺酸甲酯, 又稱阿斯巴甜或甜味素,具有甜度高、熱量低等特點，是一種被廣泛應用的人工甜味劑[4，5]。然而，阿司帕坦的安全性一直存在著較大爭議[6-8],我國GB 2760—2011[9]《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定了阿司帕坦在乳飲料中的最大用量為0.6 g/kg。目前阿司帕坦的檢測方法較為成熟[10-16]，但相關的不確定度分析確鮮有報道[17]，而液相色譜法測定乳飲料中阿司帕坦含量的相關研究基本空缺。

本文參照JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[18]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，按照GB/T 22254—2008《食品中阿司帕坦的測定》[19]，利用液相色譜法測定乳飲料中阿司帕坦的含量，根據數學模型對各影響分量的不確定度分別進行評估，評定乳飲料中阿司帕坦測定的不確定度[20-24]，為實驗室質量控制提供了科學、準確的依據，同時為其他食品添加劑測定的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Alliance 2695液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器)，美國Waters 公司；BS224S型電子天平,德國sartorius公司；Milli-Q Acadaemic型超純水儀,美國Millipore公司；CR22GⅢ型離心機，日本日立公司；色譜純甲醇、乙醇，美國Fisher公司；阿司帕坦標準品，德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度99.0%。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm) ；流動相：甲醇+水(39+61)；流速：0.8 mL/min；二極管陣列檢測器，檢測波長208nm；進樣體積：10 μL；柱溫：30℃。

1.3 前處理過程

稱取約5 g試樣(精確到0.001 g)，于50mL離心管，加入10mL乙醇，顛倒數次(不能振搖)，靜置1min，4000 r/min離心5min，上清液濾入25ml容量瓶，沉淀用5mL乙醇+水(2+1)洗滌，離心后合并上清液，用乙醇+水(2+1)定容至刻度，過濾后上機測定。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取阿司帕坦固體標準品100.0mg，置于100 mL容量瓶中，用二次水溶解并定容至刻度，得1.00mg/mL阿司帕坦標準儲備液。

準確移取10 mL標準儲備液，置于100mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得100 mg/L標準使用液。

準確移取5 mL100 mg/L標準使用液，置于10mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得50 mg/L標準使用液。

準確移取2.5 mL1.0 mg/mL標準儲備液，置于100mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得25 mg/L標準使用液。

分別準確移取6.0 mL和2 mL25 mg/L標準使用液，置于兩個10mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得15 mg/L和5 mg/L標準使用液。

2 模型建立

2.1 數學模型

式中：

X：樣品中阿司帕坦的含量(g/kg)；

C：由標準曲線計算出進樣液中阿司帕坦的濃度(μg/mL)；

V：樣品溶液定容體積(mL)；

f：樣品溶液稀釋倍數；

m：樣品的質量(g)。

2.2 不確定度分量的主要來源

經分析可知，不確定度分量的主要來源是配制標準溶液產生的不確定度ur(Cs)、擬合工作曲線過程中產生的不確定度ur(Cpred)、樣品稱量的不確定度ur(m)、樣品前處理定容時產生的不確定度ur(V)和測量重復性產生的不確定度ur(Xpred)。

3 不確定度的評定

3.1 配制標準溶液產生的不確定度ur(Cs)

3.1.1 固體標準品產生的相對標準不確定度ur(S)

阿司帕坦固體標準品的純度為99%，不確定度為0.5%，包含因子k=2，則阿司帕坦標準品產生的標準不確定度為：u(S)= 0.5%/2=0.0025，相對標準不確定度為：ur(S)=0.0025/99%= 0.0025。

3.1.2 天平稱量產生的相對標準不確定度ur(M1)

3.1.3玻璃量器校準引入的相對標準不確定度ur(Vg)

玻璃量器校準引入的不確定度見表1。

表1 玻璃量器校準引入的不確定度

根據表1，合成相對標準不確定度：

3.1.4 標準溶液配制中溫度變化產生的不確定度ur(Vt)

表2 溫度變化引起的不確定度

根據表2，合成相對標準不確定度：

綜合得配制標準儲備液的合成相對標準不確定度為：

ur(Cs)=ur(S)2+ur(M1)2+ur(Vg)2+ur(Vt)2-0.0067

3.2擬合工作曲線求Cpred過程中產生的不確定度ur(Cpred)

用液相色譜分別測定系列工作曲線濃度點的強度值，每個濃度點重復測定3次，結果見表3。

表3 工作曲線濃度點對應的響應值

利用表3中的數據，使用線性最小二乘法擬合標準工作曲線，得線性回歸方程A= 40415×C-155540 ，相關系數r2= 0.9994 ，斜率a=40415 ，截距b=-155540。由標準工作曲線求Cpred時產生的標準不確定度按下式計算：

u(Cpred)=sa1p+1n+(Cpred-)2∑ni=1(Ci-)2

其中s=∑Ni=1[Ai-(aCi+b)]2n-2,=∑ni=1Cin

式中：

u(Cpred)：繪制標準工作曲線求Cpred時產生的標準不確定度，mg/L；

s：從標準工作曲線求得的強度值與實際測定強度值之差按貝塞爾公式求出的標準偏差；

a、b：分別表示標準工作曲線的斜率(L/mg)、截距；

p：樣品重復測定的次數，p= 6；

Cpred：標準工作曲線求出的測試液中阿司帕坦的濃度，mg/L；

Ci：系列標準工作溶液對應的濃度(mg/L)；

Ai：標準溶液峰面積；

n:測定總次數，n=15。

ur(Cpred)=u(Cpred)/Cpred=0.019

3.3 樣品稱量的相對不確定度ur(m)

電子示天平的分度為0.1mg，k=3，則樣品稱量的標準不確定度為：

u(m) =0.1/3=0.058mg，相對標準不確定度為：ur(m) =0.058×10-3/5.0000=0.000012

3.4 樣品前處理產生的標準不確定度ur(V)

樣品前處理產生的不確定度，即定容至25mL容量瓶時產生的不確定度。

3.4.1 玻璃量器校準引起的不確定度ur1(V)

A類25mL容量瓶的最大允許誤差為±0.03 mL，按矩形分布考慮，K=3，則用25 mL容量瓶定容產生的相對標準不確定度為：ur1(V2) =0.0325×3= 0.00069。

3.4.2 溫度變化引起的不確定度ur2(V)

水的體積膨脹系數(α)為2.1×10-4℃-1, 溫度變化按矩形分布計算，k=3，實驗室溫度在±5℃范圍變動，在此范圍內，環境溫度變化引起的相對標準不確定度ur2(V)=5×2.1×10-4/3=0.00061

因此，定容產生的合成相對不確定度為：

ur(V)=ur1(V)2+ur2(V)2-0.00092。

3.5 測量的重復性產生的相對標準不確定度ur(Xpred)

對實驗樣品平行測定6次，得到的結果見表4。

表4 重復測定結果

重復測定產生的標準偏差：

s(Xpred)=∑nj=1(Xj-Xpred)2j-1=0.0036 g/kg；

標準不確定度為：

u(Xpred)=s(Xpred)j=0.00366=0.0015 g/kg；

測量重復性產生的相對標準不確定度：

ur(Xpred)=u(Xpred)Xpred=0.00150.118=0.013。

4 相對標準不確定度的合成與擴展

以上所有分量合成的相對標準不確定度為：

Ux/X=ur(Cs)2+ur(Cpred)2+ur(m)2+ur(V)2+ur(Xpred)2

=0.024

取包含因子k=2，則乳飲料中阿司帕坦含量測量結果的擴展不確定度為：

U=k×Ux=2×0.118×0.024=0.006 g/kg

5 結果與討論

液相色譜法測定乳飲料中阿司帕坦含量，當取樣量為5.000 克時，k=2(95%置信度)，測量結果為(0.118±0.006)g/kg。

由計算結果可看出，在液相色譜法測定乳飲料中阿司帕坦含量的過程中，通過對各分量的不確定度評定可知，標準曲線擬合產生的不確定度分量影響最大，其次是重復測量產生的不確定度，實際操作過程中可通過增加混合標準系列工作液測定次數、增加平行樣測定次數等方式減小引入的不確定度，從而提高檢測質量。

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