6-OHDA定向毀損雙側間腦A11核團對SD大鼠行為學的影響

程 靜 章正祥★ 陳 強 邵敏峰 周會霞 唐毅華 侯 群

不安腿綜合征（RLS）是一種常見的神經系統疾病，其主要表現為休息或安靜時下肢感覺不適，夜間尤其劇烈，需要或強迫性活動下肢以緩解癥狀［1］。睡眠期間周期性腿部運動（PLMS）是RLS中最重要的客觀發現［2］。既往研究發現當間腦多巴胺神經元受損時能夠導致RLS感覺癥狀的發生。目前國內外尚無理想的大鼠RLS動物模型。而本研究目的在于通過觀察6-羚基多巴胺（6-OHDA）毀損SD大鼠雙側間腦 A11核團對大鼠行為學的影響，并評價使用該方法建立 RLS動物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級SD雄性大鼠21只，體重150g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2013-0016。6-OHDA H116（美國Sigma-Aldrich公司），L-抗壞血酸A5960（美國Sigma-Aldrich公司），小鼠抗大鼠TH單克隆抗體T1299（美國Sigma-Aldrich公司，山羊抗小鼠 IgG/HRP 聚合物PV-6002（北京中杉金橋生物技術有限公司）。腦立體定位儀ALC-H（上海奧爾科特生物科技有限公司），微量注射泵ALC-IP 600（上海奧爾科特生物科技有限公司）。10μl微量進樣器（針頭錐形，針尖外徑0.5mm，針長51mm，上海高鴿工貿有限公司），高清攝像機HC-V210M（日本松下電器產業株式會社），冰凍切片機HM 550（德國美康儀器設備有限公司），顯微成像系統DS-U2（日本尼康公司）等。

1.2 下丘腦毀損手術 21只SD雄性大鼠經過20d適應性飼養后，根據體重將所有動物完全隨機分成三組，分別為空白組3只，假手術組9只，毀損組9只。用1%的戊巴比妥（6ml/kg）麻醉后，開始進行間腦A11毀損手術。調整微量進樣器距針尖8.0mm段與定位儀平面垂直，并用75%酒精消毒，固定于腦立體定位儀上。頭部消毒后，切開頭皮和筋膜，鈍性剝離骨膜，暴露前囟和人字點，通過調整門齒桿到耳桿下（4.5±1.0）mm來達到顱平位（前囟與人字點水平高度相差0.1mm以下），對兩側A11進行定位鉆孔（前囟尾側3.0mm，腹側8.0mm，矢狀縫旁開0.5mm）［3］。微量注射器以2mm/min的速度進針，進至目標深度后停留5min，再以1μl/min的速度緩慢給藥，毀損組注射4μl 0.2%6-OHDA（含0.1%維生素C），假手術組注射4μl 0.1%維生素C生理鹽水，停留10min，接著以2mm/min的速度退針，最后用碘伏消毒并縫合傷口?？瞻捉M不進行任何處理。

1.3 行為學觀察及評價 術后第8天將大鼠放入測試籠中，從9：00～9：30am開始用高清攝像機錄制6h視頻。統計3h站立、爬籠、入睡次數及總時間［4］。（1）站立：用雙后肢站立，雙前肢無任何支撐，但并不代表身體和箱底垂直，身體完全伸展和不完全伸展均為站立，爬籠后雙肢均抬離桶壁后重新記作站立。站立時間：開始站立至任一前肢接觸箱體的時間。（2）爬籠：保持直立的姿勢靠在箱壁上，包括單個前肢和雙前肢接觸箱壁，直立后單肢或雙肢觸及桶壁后重新記作爬籠。爬籠時間：開始爬籠至雙前肢均離開箱壁的時間。（3）睡眠：閉目并且俯臥著，全身（包括頭部、鼻毛等）保持不動≥30s。睡眠時間：開始入睡至清醒的時間。1.4 取材 各組大鼠在視頻錄制結束后予1%戊巴比妥鈉（5ml/kg）麻醉，取腹主動脈血5ml，離心取血清2ml于-20℃儲存備用，將動物仰臥位固定，開胸用灌流針行左心室穿刺，至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水200～300ml，至右心耳流出澄清液體，然后灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液200～300ml，先快后慢灌注，至上肢、頸部僵直，即固定完成，灌注后取大鼠腦組織，在4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液中再固定12～24h，然后用4℃30%蔗糖-PBS液脫水72h，擦干表面液體，鋁箔紙包裹，于液氮中速凍10～15s左右，存于-80℃冰箱。

1.5 免疫組化 根據《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）對下丘腦A11進行定位。在-20℃的恒溫箱中連續切片，厚度為30μm，每只大鼠取26～28張進行染色，染色方法為漂片染色法。所有A11切片在同一物鏡（×4）下用顯微成像系統進行照片采集。剔除只含黑質、A13等部位的切片，最終每只大鼠取12張切片，人工計數A11部位酪氨酸羥化酶（TH）多巴胺神經元的數目，并分左右進行統計。A11多巴胺能神經元呈三角形或多極狀，有較長的突起［5］。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。正態計量資料以（x±s）表示，非正態計量資料以中位數（四分位間距）表示。正態性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗法；若數據符合正態分布，方差齊，≥3組采用單因素方差分析，若方差不齊，采用Games-Howell檢驗，組間比較采用SNK法；兩組采用獨立樣本t檢驗。方差不齊者，≥3組采用非參數檢驗的Kruskal-Wallis法，其中兩兩比較采用所有成對比較法；兩組組間比較采用非參數檢驗的Mann-Whitney U檢驗，精確方法。各組資料均以α=0.05為顯著性水平。

2 結果

2.1 間腦A11 TH免疫組化結果 TH是多巴胺（DA）合成的限速酶，是神經系統多巴胺能神經元的蛋白標志，注射6-OHDA會導致多巴胺能神經元的死亡。TH表達于胞漿內，呈棕黃色，A11多巴胺神經元的胞體和突起均有表達，模型組雙側A11經過6-OHDA注射后，TH表達明顯減少。A11從下丘腦背側區（DA）的后端延伸至導水管周圍灰質的最前端，其嘴側主要位于乳頭體丘腦束（mt）的內側，是TH陽性細胞分布最為密集的區域，越靠近尾側，TH表達越少。人工計數法統計A11部位TH陽性表達的神經元數量，每個樣本統計12張，見表1。毀損組左側A11 TH陽性細胞總共有（114±23）個，明顯低于假手術組左側（150±22）個和正常組左側（169±14）個，差異均有統計學意義（P＜0.05）。毀損組右側A11 TH陽性細胞共有（102±20）個，明顯低于假手術組右側（147±22）個和空白組右側（155±21）個，差異均有統計學意義（P＜0.05）。假手術組左側TH陽性表達數與正常組左側相比差異無統計學意義（P＞0.05）。假手術組右側A11 TH陽性表達數與空白組右側相比差異無統計學意義（P＞0.05）。單側A11多巴胺神經元數量=12張切片同側A11多巴胺神經元數量之和，毀損率=1-單側A11多巴胺神經元數量/空白組同側A11多巴胺神經元數量的均值，統計得到毀損組與假手術組毀損率見表2。毀損組左側毀損率有（32.28%±13.87）%，明顯高于假手術組左側（11.07%±13.04）%，差異有統計學意義（P＜0.01），毀損組右側毀損率有（33.76%±12.92）%，明顯高于假手術組右側（4.89%±14.09）%，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖 1～3。

表1 間腦A11雙側毀損TH陽性細胞表達比較［個，（±s）］

表1 間腦A11雙側毀損TH陽性細胞表達比較［個，（±s）］

注：與毀損組比較，*P＜0.05

組別 n 左 右空白組 3 169±14* 155±21*假手術組 9 150±22* 147±22*毀損組 9 114±23 102±20 F值 - 9.577 12.878 P值 - 0.001 0.000

表2 間腦A11雙側毀損TH毀損率比較［%，（±s）］

表2 間腦A11雙側毀損TH毀損率比較［%，（±s）］

組別 n A11左側 A11右側假手術組 9 11.07±13.04 4.89±14.09毀損組 9 32.28±13.87 33.76±12.92 t值 -3.342 -4.531 P值 0.004 0.000

2.3 行為表現觀察結果 術后第8天，將大鼠放入桶中，用高清攝像機錄制6h視頻。記錄下3h的爬籠、站立及睡眠出現的次數及每次持續的時間，并統計前3h爬籠、站立、睡眠次數及總時間。分析后發現3h內各個行為次數及總時間均無明顯差異。見表3。

表3 間腦A11雙側毀損行為學變化組間比較［（±s，M（Q）］

表3 間腦A11雙側毀損行為學變化組間比較［（±s，M（Q）］

組別 爬籠次數(次) 爬籠時間(s) 站立次數(次) 站立時間(s) 睡眠次數(次) 睡眠時間(s)空白組 123±40.51 506±137.96 128.67±33.56 468.33±157.15 10.67±3.21 813.67±199.04組 98.78±64.21 481.67±427.48 83.89±79.24 407.11±387.57 10.00(45.00)843.00(3467.50) 137.22±73.95 889.56±618.44 59.89±53.19 262.78±208.86 18.00(23.50)1425.56±818.93 0.755 1.641 1.304 0.785 - -0.480 0.220 0.300 0.470 0.791 0.568

圖1-1 正常組A11（物鏡×4）

圖1-2 正常組A11左側（物鏡×10）

圖1-3 正常組A11右側（物鏡×10）

圖2-1 假手術組A11（物鏡×4）

圖2-2 假手術組A11左側（物鏡×10）

圖2-3 假手術組A11右側（物鏡×10）

圖3-1 毀損組A11（物鏡×4）

圖3-2 毀損組A11左側（物鏡×10）

圖3-3 毀損組A11右側（物鏡×10）

3 討論

長期臨床觀察研究顯示RLS患者無帕金森樣癥狀，但在長期應用多巴胺能藥物治療期間，帕金森患者RLS的累積發病率出現下降［6］，說明RLS的發生與多巴胺有關。間腦A11核團是脊髓多巴胺唯一來源，因此推測RLS的發生與間腦A11的受累與多巴胺的減少密切相關。

本研究在Ondo等［4］研究的基礎上，增加樣本量，對大鼠雙側間腦A11核團進行立體定向毀損，并進一步細化行為學評價標準，采用統計站立、爬籠、睡眠次數和時間評價其行為學，免疫組化結果顯示A11毀損組TH毀損率明顯高于假手術組，說明間腦A11毀損成功。行為學結果顯示模型組總的爬籠次數、爬籠時間有增多，但并無顯著的統計學差異。

以往6-OHDA毀損間腦A11相關研究顯示，對A11毀損模型尚未形成統一的行為學評價標準，難以客觀評價大鼠的感覺異常。本實驗結果可能由于行為學評估標準中某些指標并不能反映大鼠的感覺異常，行為學評價標準有待進一步改善和細化，例如將爬籠行為細分為單肢爬籠和雙肢爬籠，站立行為細分為身體完全伸展并垂直于箱底的站立（直立）和身體不完全伸展的站立。在觀察大鼠行為學過程中發現，大鼠睡眠中可出現身體擺動，而RLS常可表現睡眠中周期性肢體動作，觀察指標中加入不動行為（即在睡眠中≥2s四肢及全身保持完全不動的次數及時間），可評估這一臨床表現。另外，在行為觀測過程中將大鼠放入透明玻璃箱中，利用鏡面反射拍攝箱底，則能觀察大鼠在睡眠過程中的肢體活動，更能反映PLMS患者在休息時腿部的異常感覺。為了完善本研究，建議今后的實驗還可使用儀器監測24h運動活性、肌電圖、腦電圖評價生理指標，更加客觀地評價大鼠的感覺異常。因此，6-OHDA定向毀損SD大鼠雙側間腦A11，是否能作為RLS動物模型還需要進一步實驗。

［1］ 林曉東, 趙麗． 不安腿綜合征研究進展． 河北醫藥, 2011, 33(2):263-265．

［2］ Ferri R, Koo BB, Picchietti DL, et al． Periodic leg movements during sleep: phenotype, neurophysiology, and clinical significance．Sleep medicine, 2017, 31: 29-38．

［3］ G Paxinos, C Watson． The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates,6th edition． San Diego: Academic Press, 2007, 3(2): 6．

［4］ Ondo WG, He Y, Rajasekaran S, et al． Clinical correlates of 6-hydroxydopamine injections into A11 dopaminergic neurons in rats: a possible model for restless legs syndrome． Movement disorders: official journal of the Movement Disorder Society, 2000,15(1): 154-158．

［5］ Qu S, Ondo WG, Zhang X, et al． Projections of diencephalic dopamine neurons into the spinal cord in mice． Experimental Brain Research, 2006, 168(1): 152-156．

［6］ Marchesi E, Negrotti A, Angelini M, et al． A prospective study of the cumulative incidence and course of restless legs syndrome in de novo patients with Parkinson's disease during chronic dopaminergic therapy． Journal of neurology, 2016, 263(3): 441-447．