非小細胞肺癌組織Twist、N-cadherin表達及臨床意義

武國煜，冼磊，莫俊賢，盧銳

(廣西醫科大學第二附屬醫院，南寧530021)

Twist是一種堿性螺旋-環-螺旋結構的DNA 結合轉錄因子，具有原癌基因的特性。N-cadherin是由18號染色體上基因編碼的、相對分子量為127 000 kD的蛋白，主要功能是參與細胞黏附、凋亡、增殖、遷移及識別信號轉導等。近年研究發現，Twist和N-cadherin與腫瘤侵襲轉移及患者預后密切相關[1～5]，但二者與非小細胞肺癌(NSCLC)發生發展的關系報道較少。本研究探討Twist與N-cadherin在NSCLC發生、發展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2014年6月～2015年5月我院收治的初診NSCLC患者75例(NSCLC組)，男34例、女41例，年齡39～81(56.77±9.32)歲。均行手術治療，術后病理檢查證實診斷。手術切除腫瘤組織，并留取距離癌組織邊緣>5 cm的正常肺組織。TMN分期Ⅰ期22例、Ⅱ期25例、Ⅲ期16例、Ⅳ期12例，中高分化42例、低分化33例。術前未經任何放化療。對照組為同期收治的12例行手術治療的肺部良性疾病患者，男8例、女4例，年齡21～62(44.58±15.12)歲；肺大皰3例、支氣管擴張2例、炎性假瘤5例、結核球2例。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2肺組織Twist和N-cadherin mRNA表達檢測NSCLC組取手術切除的腫瘤組織及其癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)標本；對照組取手術切除的相應病變組織標本，組織標本離體后15 min內放置于-80 ℃冰箱中保存。采用實時熒光定量PCR技術檢測兩組Twist和N-cadherin mRNA表達。具體步驟：采用mRNA提取試劑盒(TIGEN公司)按照說明書步驟在低溫環境下提取標本總mRNA，采用分光儀根據OD260/OD280評估所提取mRNA的質量，并計算mRNA濃度。將提取的mRNA根據濃度稀釋配比，采用逆轉錄試劑盒(TIGEN公司)逆轉錄成cDNA。采用SuperReal熒光定量預混試劑增強版(TIANGEN公司)實時熒光定量PCR技術檢測標本中Twist和N-cadherin mRNA表達量。引物及內參均由武漢金開瑞生物工程有限公司設計并合成。反應條件：95 ℃預變性 2 min、94 ℃變性 20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環。

1.3肺組織Twist、N-cadherin蛋白表達檢測采用免疫組化SP法。取兩組手術標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，采用0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液抗原修復，染色步驟按SP試劑盒說明書進行，DAB顯色，并用已知Twist、N-cadherin陽性的肺癌切片作為陽性對照，用枸櫞酸緩沖液PBS代替一抗或橋抗作為陰性對照。兔抗Twist、N-cadherin單抗購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組織化學SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。結果判定：① Twist陽性染色主要著位于胞質，細胞核中亦有表達，以細胞呈清晰棕色或棕褐色為陽性。在高倍鏡下任選 10個高倍視野計數，以細胞呈清晰的棕色或棕褐色且陽性細胞數>25%為陽性，以細胞無棕褐色或與背景一致的淡棕色為陰性。② N-cadherin陽性染色為棕黃色，定位于細胞膜和(或)細胞質。按陽性細胞數占視野中總細胞數的百分比分為陽性與陰性。每例切片選擇10個高倍視野，無陽性著色或陽性細胞數<20%為陰性，陽性細胞數≥20%為陽性。分析NSCLC組織 Twist、N-cadherin陽性表達與患者臨床病理特征的關系。

2　結果

2.1兩組Twist、N-cadherin mRNA表達比較NSCLC組癌組織Twist、N-cadherin mRNA相對表達量均高于癌旁組織和對照組(P均<0.01)。見表1。

表1　三組Twist、N-cadherin mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與癌旁組織比較，△P<0.01。

2.2兩組Twist、N-cadherin蛋白表達比較NSCLC組癌組織Twist、N-cadherin蛋白陽性表達率分別為73.3%(55/75)、77.3%(58/75)，癌旁組織分別為18.6%(14/75)、14.6%(11/75)，對照組分別為0、16.6%(2/12)，NSCLC組癌組織Twist、N-cadherin蛋白陽性表達率均高于癌旁組織和對照組(P均<0.05)。

2.3癌組織Twist、N-cadherin陽性表達與患者臨床病理特征的關系NSCLC患者有淋巴結轉移及臨床分期Ⅲ、Ⅳ期者Twist、N-cadherin陽性表達率高于無淋巴結轉移及Ⅰ、Ⅱ期者(P均<0.01)，性別、年齡及分化程度對Twist、N-cadherin陽性表達率無明顯影響(P均>0.05)。見表2。

2.4NSCLC組織Twist與N-cadherin陽性表達的關系NSCLC組53例Twist與N-cadherin均表達均陽性，15例表達均陰性，Twist陽性表達與N-cadherin陽性表達呈正相關(r=0.583，P<0.01)。

表2　　　　NSCLC組織 Twist、N-cadherin陽性表達與患者臨床病理特征的關系

3　討論

Twist在胚胎中胚層時期就已形成，正常情況下主要表達于胚胎中胚層、胎盤以及成人某些中胚層來源的未分化組織[4]。Twist在胚胎發育期對促進細胞重建、組織器官形態構建有重要作用，可在轉錄水平調控許多基因表達，進而發揮調控細胞增殖分化、器官生長發育的作用[5]；另外，Twist基因具有原癌基因的特性，能夠通過多種途徑抑制腫瘤細胞的凋亡過程。研究發現，Twist在人類多種上皮來源腫瘤中表達升高，提示其與癌細胞的早期轉移和患者預后密切相關[6～10]，甚至在某些腫瘤可作為其預后的獨立預測因子[11]。有研究發現，轉錄因子Twist可通過影響Bmi-1，共同調控EMT和腫瘤干細胞樣特性[12，13]。EMT是多細胞生物胚胎發育的基本過程，參與多種慢性疾病的發生發展以及腫瘤的形成，其主要特征為E-cadherin表達下降，N-cadherin表達上調；角蛋白為主的細胞骨架轉化為波形蛋白為主的細胞骨架；形態上由上皮細胞轉化為具有間充質特征的細胞等。這些特征使腫瘤細胞喪失細胞與細胞之間的連接，侵襲性更強[14]。

N-cadherin通常在來源于神經外胚層和中胚層的器官中表達較多，如成熟的肌肉、神經和造血組織，在正常上皮組織通常不表達。N-cadherin是Ca2+依賴性的一種跨膜蛋白，主要功能是參與細胞黏附、凋亡、增殖、遷移及識別信號轉導等，進而改變上皮細胞形態和生物學功能，可將上皮細胞轉變為間質細胞，也就是EMT過程[15,16]。因此，N-cadherin異常高表達可促進腫瘤的浸潤和轉移，其不但可促使癌細胞從腫瘤組織上脫落，還能使癌細胞與內皮或基質成分黏附，使腫瘤侵襲轉移能力大大增強[2]。另外，N-cadherin的異常高表達有助于血管形成及EMT，從而使腫瘤細胞更加富于侵襲性，進一步促進轉移[17]。

本研究結果顯示，NSCLC組織Twist與N-cadherin陽性表達明顯高于癌旁組織和良性病變組織，這與在鼻咽癌和宮頸癌中的研究結果一致[18，19]。本研究進一步發現，Twist與N-cadherin陽性表達與患者的臨床分期和淋巴結浸潤有關，臨床分期越晚、有淋巴結轉移者Twist 與N-cadherin表達水平越高，但二者表達與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無關；上述結果與Nakajima等[20]在胰腺癌中的研究結果一致。提示Twist與N-cadherin可能促進肺癌細胞增殖分化以及腫瘤血管生成，可能作為預測肺癌細胞轉移的指標。

對果蠅的研究發現，Twist可以激活N-cadherin；在MKN28細胞中轉染Twist后，細胞中N-cadherin表達上調[21,22]。本次研究結果顯示，NSCLC組織中Twist、N-cadherin陽性表達呈正相關，與Ding等[23]在胃腸間質腫瘤中的研究結果一致，提示兩者協同表達可能是由共同的信號轉導通路實現的，但具體的通路還需進一步研究認證。

綜上所述，Twist、N-cadherin可促進NSCLC的發生及發展；在此過程中二者具有協同作用。

參考文獻：

[1] Lopez D, Niu P, Huber P, et al. Tumor-induced upregulation of Twist, Snail, and Slug represses the activity of the human VE-cadherin promoter[J]. Arch Biochem Biophys, 2009,482(1-2):77-82.

[2] Suyama K, Shapiro I, Gutman M, et al. A signaling pathway leading to metastasis is controlled by N-cadherin and the FGF receptor[J]. Cancer Cell, 2002,2(4):301-314.

[3] 李自強,張華東,黃勇.Twist蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及其與預后關系[J].解放軍醫藥雜志,2011,3(4):12-14.

[4] Xiao S, Li D, Corson MJ, et al. Codeletion of p15 and p16 genes in primary non-small cell lung carcinoma[J]. Cancer Res, 1995,55(14):2968-2971.

[5] Valdés-Mora F, Gómez del Pulgar T, Bandrés E, et al. TWIST1 overexpression is associated with nodal invasion and male sex in primary colorectal cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2009,16(1):78-87.

[6] Zhang YQ, Wei XL, Liang YK, et al. Over-expressed twist associ-ates with markers of epithelial mesenchymal transition and predicts poor prognosis in breast cancers via ERK and Akt activa-tion[J]. PLoS One, 2015,10(8):e0135851.

[7] Zhang H, Gong J, Kong D, et al.Anti-proliferation effects of Twist gene silencing in gastric cancer SGC7901 cells[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(10):2926-2936.

[8] Lim JC, Koh VC, Tan JS, et al. Prognostic significance of epithelial-mesenchymal transition proteins Twist and Foxc2 in phyllodes tumours of the breast[J]. Breast Cancer Res Treat, 2015,150(1):19-29.

[9] Fan Q, Qiu MT, Zhu Z, et al. Twist induces epithelial-mesenchy-mal transition in cervical carcinogenesis by regulating the TGF-β/Smad3 signaling pathway[J]. Oncol Rep, 2015,34(4):1787-1794.

[10] Zhuo X， Chang A， Huang C， et al. Expression of TWIST， an inducer of epithelial-mesenchymal transition， in nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(12):8862-8868.

[11] Raatikainen S, Aaltomaa S, Palvimo JJ, et al. TWIST overexpres-sion predicts biochemical recurrence-free survival in prostate cancer patients treated with radical prostatectomy[J]. Scand J Urol, 2015,49(1):51-57.

[12] Wu KJ. Direct activation of Bmi1 by Twist1: implications in cancer stemness, epithelial-mesenchymal transition, and clinical significance[J]. Chang Gung Med J, 2011,34(3):229-238.

[13] 楊丞,饒翔,羅志飛,等.宮頸鱗狀上皮病變中Twist、Bcl-2 蛋白的表達及意義[J].海南醫學院學報,2013,19(7):888-891.

[14] Pallier K, Cessot A, Cote JF, et al. TWIST1 a new determinant of epithelial to mesenchymal transition in EGFR mutated lung adenocarcinoma[J]. PLoS One, 2012,7(1):e29954.

[15] Dong O, Wu Y, Wang Y, et al. Interaction with Suv39H1 is critical for Snail-mediated E-cadherin repression in breast cancer[J]. Oncogene, 2013,32(11):1351-1362.

[16] Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. Thrombomodulin reduces tumorigenic and metastatic potential of lung cancer cells by up-regulation of E-cadherin and down-regulation of N-cadherin expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,476(4):252-259.

[17] Cheng GZ, Chan J, Wang Q, et al. Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration, invasion, and resistance to paclitaxel[J]. Cancer Res, 2007,67(5):1979-1987.

[18] Song LB, Liaso WT, Ma HQ, et al. The clinical significance of twist expression in nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Lett, 2006,242(2):258-265.

[19] Shibata K, Kaijiyama H, Ino K, et al. Twist expression in patients with cervical cancer is associated with poor disease outcome[J]. Ann Oncol, 2008,19(1):81-85.

[20] Nakajima S, Doi R, Toyoda E, et al. N-cadherin expression and epithelial-mesenchymal transition in pancreatic carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(12 Pt 1):4125-4133.

[21] Oda H, Tsukita S, Takeichi M. Dynamic behavior of the cadherin-based cell-cell adhesion system during Drosophila gastrulation[J]. Dev Biol, 1998,203(2):435-450.

[22] De Wever O, Westbroek W, Verloes A, et al. Critical role of N-cadherin in myofibroblast invasion and migration in vitro stimulated by colon-cancer-cell-derived TGF-beta or wounding[J]. J Cell Sci, 2004,117(Pt 20):4691-4703.

[23] Ding J, Zhang Z, Pan Y, et al. Expression and significance of twist, E-cadherin, and N-cadherin in gastrointestinal stromal tumors[J]. Dig Dis Sci, 2012,57(9):2318-2324.