RP-HPLC法測定急性溴苯腈中毒小鼠肝組織腺苷酸含量

周小明 翁杰 王志翊 龔裕強

肝臟是機體最大的解毒器官，肝細胞能量代謝是肝臟解毒功能的物質基礎，肝組織腺苷酸含量的變化直接反映肝臟能量代謝狀況，是評價肝臟損害和藥物保護效果的有效指標。目前國內外檢測組織腺苷酸含量的方法大多時間慢，過程復雜[1－2]。本實驗采用一種改良的反相高效液相色譜（RP－HPLC）法測定急性溴苯腈中毒小鼠肝組織三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量變化，旨在為研究肝臟能量代謝變化提供較為快速、理想的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 實驗小鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供，24只成年雄性SD大鼠，體重250～300g。老鼠被安置在塑料籠子，提供水和食物，自由攝食。養殖條件為12h光/暗周期，溫度保持在（24±2）℃。實驗前動物予禁食12h，不禁水，采用隨機數字表法分為急性中毒組予溴苯腈（97%溴苯腈原藥以10%二甲亞砜為溶媒配成10mg/ml溶液）200mg/kg灌胃染毒和正常對照組（予10%二甲亞砜溶液20ml/kg灌胃），每組12只，兩組均于灌胃后6h采用脊椎脫臼法處死。

1.2 儀器與試劑 高效液相色譜儀Agilent1100（美國Agilent公司），高速低溫離心機（美國Beckman公司），ATP、ADP、AMP標準品（美國 Sigma公司），97%溴苯腈原藥（浙江禾本農藥化學有限公司），乙腈（天津四友，色譜純），10%二甲亞砜溶液、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鉀、高氯酸(均為國產分析純），實驗用水為超純水。

1.3 色譜條件 日本島津C18ODS色譜分析柱（5μm，200mm×4.6mm），流動相A為150mmol/L磷酸二氫鉀溶液+150mmol/L氯化鉀溶液，用2mol/L氫氧化鉀溶液調整溶液pH值至6.0；流動相B為85%流動相A+15%乙腈，所用流動相實驗前均經0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，并行超聲脫氣泡處理。洗脫梯度：0min、3%B，5min、9%B，9min、3%B（B指流動相B），平衡8min。柱溫為16℃，檢測波長254nm；流速1.1ml/min。

1.4 肝組織樣品的制備 處死兩組小鼠后分離小鼠的肝臟組織。用液氮預冷的鐵夾鉗取肝組織，置液氮冷凍后，精確稱取肝組織0.3g，加入預冷的0.3mol/L高氯酸溶液3ml，冰浴中用研缽迅速勻漿，勻漿液6000r/min低溫4℃離心10min，取上清液，予1mol/L的氫氧化鉀調溶液pH值至6.0，再次6000r/min低溫4℃離心10min，取上清液，經0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，即得肝組織樣本溶液，吸取20μl進行分析，測定肝組織ATP、ADP、AMP 含量。

1.5 標準曲線的繪制 分別稱取ATP、ADP和AMP標準品10mg，用超純水配成1mg/ml的混合母液，分別稀釋成 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的混合標準溶液。根據進樣質量濃度和測得的峰面積求取回歸方程及相關系數。

1.6 加標回收率的計算 肝組織加入一定量的腺苷酸混合標準品，經沉淀蛋白、中和酸性等處理，測定腺苷酸含量，與同批處理的同一組織樣品比較，計算回收率，回收率=(加標測定量-不加標測定量）/加標量×100%計算標準品的回收率。

1.7 精密度的測量 上述色譜條件下，同日內對同一肝組織樣本不定時進樣6次，測得日內保留時間與峰面積變異系數；上述樣品分裝，-70℃保存，不同日進樣分析，重復6次，測得日間保留時間與峰面積變異系數。

1.8 觀察指標 觀察并比較兩組小鼠肝細胞ATP、ADP和AMP含量差異，判斷RP-HPLC法測定急性溴苯腈中毒小鼠肝組織腺苷酸含量是否符合既往研究結果，并觀察RP-HPLC法的出峰時間、標準曲線、精密度。

1.9 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，兩樣本間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 出峰時間 ATP、ADP和AMP的出峰時間分別約為5.7、6.3和8.5 min，3種標準腺苷酸分離較滿意，最小分離度R＞2.0，見圖1。

圖1 標準品色譜圖

2.2 標準曲線 結果 ATP、ADP和AMP濃度在 1～200mg/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系，所得直線方程分別為 ATP：y=23.706x-3.3611，R=0.99999；ADP：y=33.549x-15.143，R=0.99998；AMP：y=41.934x-1.6868，R=0.99999。

2.3 加標回收率 見表1。

表1 肝組織腺苷酸含量加標回收率（μg/ml）

2.4 精密度實驗 見表2。

表2 保留時間和峰面積變異系數（%）

2.5 兩組小鼠肝組織腺苷酸含量比較 與正常組對照比較，急性中毒組ATP含量明顯下降（P＜0.05），AMP含量明顯升高（P＜0.05），兩組小鼠ADP含量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表3。

圖2 急性中毒組小鼠肝組織ATP、ADP和AMP含量變化

表3 兩組小鼠肝組織腺苷酸含量比較（μg/g）

3 討論

ATP等能量物質是研究疾病能量代謝變化的重要指標[3]，屬于不穩定化合物，且生物組織、血漿中存在降解ATP等的酶，為避免實驗過程中能量物質的降解，本研究采用低溫、加酸使酶失活，抽提ATP時要應盡快將標本移入預冷的高氯酸溶液中，在冰浴中迅速勻漿，使肝細胞破碎，充分提取細胞中的ATP，確保檢測結果真實反映肝組織能量代謝情況。本ATP提取方法是目前國內外廣泛采用的技術，方法較成熟，具有簡便、提取完全等優點。

腺苷酸含量的測定以往多采用電泳、層析或酶學等分析方法，但這些方法操作復雜，靈敏度低，難以推廣應用。目前檢測腺苷酸含量最常用的分析方法為高效液相色譜（HPLC）法[1-2，4]。筆者采用 RP-HPLC 法，與常規HPLC法相反，RP-HPLC是流動相極性大于固定相極性的色譜。此方法改善了常規色譜中固定液流失分離效果差的缺點，除具備HPLC法的特點外，具有柱效高、靈敏度高、更敏捷等優勢[5-7]。RP-HPLC法流動相的種類和配比對分離效果影響很大，筆者采用乙腈磷酸緩沖液作流動相，梯度洗脫，但每次運行梯度洗脫后需重新平衡色譜柱，耗時較長。本研究通過加大流速，改變梯度變化速率，縮短梯度時間等措施，使運行時間明顯縮短，樣品主峰9min內便獲得較好分離?；厥章?、精密度實驗表明，該方法準確性高、重復性較好。

本研究增加實驗樣本量，通過RP-HPLC法測得急性溴苯腈中毒小鼠肝組織ATP含量明顯低于正常小鼠，AMP含量明顯升高，與文獻[8]報道一致，表明小鼠溴苯腈急性中毒可導致肝臟能量代謝障礙。此外，該技術方法在腦損傷疾病能量代謝研究中也有重要的應用價值[9-11]。RP-HPLC法可快速、靈敏、準確檢測不同能量代謝狀態下不同組織腺苷酸含量變化，是研究臨床疾病能量代謝變化的理想方法，在臨床中毒毒理研究[12-13]、生命科學等[14]領域均有一定的應用價值。

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