巨噬細胞與肝癌轉移及臨床預后關系研究*

陳 霞，張國尊，劉瑩瑩，梁育飛，李春英，張秀剛，鄭國啟

河北省滄州市中心醫院消化內一科(滄州 061001)

巨噬細胞與肝癌轉移及臨床預后關系研究*

陳 霞，張國尊，劉瑩瑩，梁育飛，李春英，張秀剛，鄭國啟

河北省滄州市中心醫院消化內一科(滄州 061001)

*河北省滄州市科技局科技項目(162302166)

目的：研究巨噬細胞與肝癌轉移及臨床預后的關系。方法：收集行肝癌根治性切除術治療的肝癌患者90例，采用免疫組化染色法檢測組織中巨噬細胞的特異標志物CD68和VEGF的表達，與臨床病理參數分析，并研究兩者之間的相關性。結果：CD68與VEGF在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝臟組織(P<0.05)；C-D期肝癌組織中的CD68浸潤程度顯著高于A-B期肝癌組織(P<0.05)，存在淋巴轉移的肝癌組織中的CD68浸潤程度顯著高于無淋巴轉移的肝癌組織(P<0.05)；A-B期肝癌組織中VEGF的表達顯著低于C-D期(P<0.05)，出現淋巴轉移的肝癌組織VEGF的表達顯著高于未出現淋巴轉移者(P<0.05)；肝癌組織中VEGF的陽性表達與CD68的表達呈正相關關系(P<0.05)。結論：巨噬細胞的浸潤程度和VEGF的表達水平都與腫瘤轉移和臨床分期有關，和VEGF表達呈正相關關系，CD68有望成為評估肝癌進展程度的重要指標，也為改善肝癌預后提供了新的靶點。

肝癌是常見的消化腫瘤之一，是病死率較高的三種疾病之一，嚴重威脅人類的生命健康。雖然醫療技術以突飛猛進的速度在發展，但肝癌的治療仍是醫學難題。肝癌預后較差的原因是因為其極易侵襲、轉移。隨著研究的不斷深入，學者發現存在于腫瘤微環境中的巨噬細胞在肝癌的發生、發展中起了重要作用，巨噬細胞參與上皮間質轉化、促進血管生成參與腫瘤細胞的侵襲和轉移[1]。研究證實，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)參與腫瘤細胞的發生、發展，在血管的生成過程中起重要作用。CD68是一種胞漿細胞系統，是巨噬細胞的標志物之一，本研究以CD68為巨噬細胞標志物，檢測CD68和血管內皮生長因子在肝癌組織中的表達，以明確巨噬細胞在肝癌轉移及預后的關系。

資料與方法

1 一般資料 回顧性收集2015年9月至2016年12月來我院行肝癌根治性切除術治療的肝癌患者90例，均具有完整的臨床資料，術前均未為采取任何手段的抗腫瘤治療，術后檢驗病理標本證實為肝癌。90例肝癌患者中，男性57例，女性33例，年齡25～76歲，平均年齡(54.92±1.34)歲；AFP≥400μg/L41例，<400μg/L 49例；分化程度：低40例，高50例；腫瘤包膜完整者30例，無腫瘤包膜60例；肝癌巴塞羅那(BCLC)分期：A-B期51例，C-D期39例；淋巴結轉移52例，無淋巴結轉移38例；血管侵犯65例，無血管侵犯25例。本研究經我院倫理學批準，患者及家屬知情同意。

2 研究方法

2.1 CD68的表達測定：采用免疫組化染色法，免疫組化試劑盒由北京中山金橋生物公司提供。甲醛固定肝癌標本，石蠟包埋，做成3μm厚的切片，請2位病理醫師按照操作步驟觀察、評分。隨機選擇10個高倍鏡下的不同視野，統計胞漿內可見的棕黃色的顆粒所占的百分比，采取半定量標準[2]，<10%為陰性，≥10%為陽性。試驗中陽性對照片由試劑公司提供，用 PBS替代第一抗體作陰性對照。

2.2 VEGF的表達測定：隨機選擇10個高倍鏡下的不同視野，鏡下計數100個細胞，根據染色強度和陽性細胞百分比采用半積分法判定結果，陽性細胞百分比：<5%為0分，≥5%且<25%為1分，≥25%且<50%為2分，≥50%且<75%為3分，≥75%為4分；染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩項的乘積即為VEGF的表達結果。

結 果

1 CD68與VEGF在肝癌組織中的表達 研究結果顯示，CD68在巨噬細胞的胞質和胞膜中呈灶狀與片狀分布，在血管周圍集中，在肝癌組織中的表達率為94.44%(85/90)，VEGF染色為棕黃色和褐色，主要集中在細胞質，在肝癌組織中的表達率為96.67%(87/90)。CD68與VEGF在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝臟組織。

2 肝癌組織中CD68的表達與臨床病理的關系 研究結果顯示，C-D期肝癌組織中的CD68浸潤程度顯著高于A-B期肝癌組織(P<0.05)，存在淋巴轉移的肝癌組織中的CD68浸潤程度顯著高于無淋巴轉移的肝癌組織(P<0.05)，見表1。

表1 肝癌組織中CD68與VEGF表達與臨床病理關系

3 肝癌組織中VEGF的表達與臨床病理之間的關系 研究結果顯示，A-B期肝癌組織中VEGF的表達顯著低于C-D期(P<0.05)，出現淋巴轉移的肝癌組織VEGF的表達顯著高于未出現淋巴轉移者(P<0.05)，見表2。

表2 肝癌組織中VEGF的表達與臨床病理之間的關系

4 肝癌組織中CD68與VEGF表達的相關性分析 經Sperrman相關性分析，肝癌組織中VEGF的陽性表達與CD68的表達呈正相關關系(r=0.691，P<0.05)。

討 論

肝癌又稱肝細胞癌，是高發惡性腫瘤之一，而且預后差。全球每年死于肝癌的人數高達70萬，而我國每年約37萬人死于肝癌，占全球死亡人數的53%左右。雖然近年來醫學診斷和治療技術在不斷提高，但是肝癌的病死率仍居高不下[3]。目前，最具臨床診斷價值的肝癌標志物是甲胎蛋白(AFP)，據臨床資料顯示，其和肝癌的轉移和預后有密切關系。研究證實，AFP診斷肝癌存在20%以上的假陽性或假陰性[4]，因此AFP對肝癌的評估價值有一定的爭議。目前，尋找更可靠、更準確的診斷指標是肝癌研究領域的迫切任務，這對患者病情的有效診斷以及后期治療有重要意義。

研究顯示，腫瘤微環境對腫瘤的發生、發展起到了重要的促進作用[5]。而存在于腫瘤微環境中的腫瘤巨噬細胞通過影響介質的產生以及周圍血管的生成來促進腫瘤的浸潤和轉移，其對腫瘤預后有重要意義，已成為眾多學者研究的熱點[6]。腫瘤的外周轉移是腫瘤細胞不斷繁殖、運動、粘附、侵襲、和宿主細胞相互作用的復雜、反復的過程，而到達微環境的單核細胞在微環境的刺激下發生不同性質的極化，其中替代性活化型巨噬細胞[7]導致宿主細胞免疫紊亂及免疫沉默，刺激腫瘤生長因子生成，誘導炎性反應[8]。Gouon-Evans等[9]通過乳腺癌小鼠模型發現，去除單核巨噬細胞，腫瘤轉移受到抑制。CD68是巨噬細胞特異性較高的生物標記物，其參與組織的修復與重建，在促進血管生成、腫瘤的侵襲轉移中起重要作用[10]。據陳利君等[11]報道顯示，肝癌組織中的CD68數量和肝癌繁殖活性密切相關，有望成為肝癌預后的重要指標。

據相關資料顯示，腫瘤組織中的巨噬細胞在腫瘤微環境的刺激下會被激活表達出一系列血管生長因子，內皮細胞生長因子(VEGF)是重要的一種[12]。巨噬細胞多聚集于厭氧環境，而腫瘤細胞的迅速生長需要消耗大量的氧氣，必然導致局部細胞缺氧和供血不足，而缺氧環境可以刺激內皮細胞生長因子以及炎性因子的高表達，巨噬細胞聚集，引發腫瘤細胞血管的生長和繁殖[13]。血管供血是腫瘤細胞繁殖和轉移的基礎，研究證實，如果新生血管停止供血，那么腫瘤細胞將停止生長，而內皮細胞生長因子有非常強的促血管生成作用，其在促進腫瘤新生血管生成、腫瘤的浸潤和轉移中發揮著重要作用[14]。本研究通過回顧性收集90例肝癌患者的臨床資料，研究了CD68和VEGF在肝癌組織中的表達以及兩者的相關性，研究結果證實，CD68在巨噬細胞的胞質和胞膜中呈灶狀與片狀分布，在血管周圍集中，在肝癌組織中的表達率為94.44%(85/90)，VEGF染色為棕黃色和褐色，主要集中在細胞質，在肝癌組織中的表達率為96.67%(87/90),CD68與VEGF在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝臟組織。90例肝癌患者中，處于A-B期的有51人，處于C-D期的有39人，出現淋巴轉移的有52人，無淋巴轉移的有38人，經檢驗結果顯示，A-B期肝癌組織中CD68的表達、VEGF的陽性率顯著低于C-D期；出現淋巴轉移的肝癌組織中CD68的表達、VEGF的陽性率顯著高于無淋巴轉移者，可見，巨噬細胞的浸潤程度和VEGF的表達水平都與腫瘤轉移和臨床分期有關，提示VEGF在腫瘤的發生、發展中起重要作用。而作為腫瘤微環境的重要組成部分，巨噬細胞通過多種途徑參與腫瘤細胞的生長、侵襲以及轉移，本研究中，肝癌組織中VEGF的陽性表達與CD68的表達呈正相關關系，可見，巨噬細胞是通過促進VEGF的表達而促進腫瘤細胞的生長和侵襲[15]。

綜上所述，巨噬細胞的浸潤程度和VEGF的表達水平都與腫瘤轉移和臨床分期有關，和VEGF表達呈正相關關系，CD68有望成為評估肝癌進展程度的重要指標，也為改善肝癌預后提供了新的靶點。

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(收稿：2017-08-02)

Macrophagesrelationswithlivercancermetastasisandclinicalprognosis

Chen Xia,Zhang Guozun ,Liu Yingying,et al.

Cangzhou Central Hospital of Hebei Province(CangZhou 061001)

Objective: To study the relationship between macrophage and metastasis of liver cancer and clinical outcome. Methods: retrospectively collected radical resection of liver cancer treatment of the clinical data of 90 patients with liver cancer, using immunohistochemical staining method to detect macrophages in the tissues of the specific markers of CD68 and the expression of VEGF, and clinical pathological parameters analysis, and study the correlation between the two. Results: the expression of CD68 and VEGF in liver cancer tissue was significantly higher than normal liver tissue (P< 0.05); C-D cancer of the liver tissue of CD68 infiltration degree was significantly higher than A-B hepatocellular carcinoma tissue (P< 0.05), degree of lymphatic metastasis of liver cancer tissue of CD68 infiltration was significantly higher than without lymph node metastasis of liver cancer tissue (P< 0.05); A-B of VEGF expression in liver cancer tissue was significantly lower than phase C-D (P< 0.05), in lymphatic metastasis of liver cancer tissue expression of VEGF was significantly higher than without lymph node metastasis (P< 0.05); The positive expression of VEGF in liver cancer tissue was positively associated with the expression of CD68 (P< 0.05). Conclusion: macrophage infiltration degree and the expression of VEGF levels are associated with tumor metastasis and clinical stage, and VEGF expression is positively related to relationship, CD68 is expected to become an important index to evaluate the degree of liver cancer progress, also provide new targets for improving the prognosis of liver cancer.

Liver neoplasms/patholgy Macrophages Neoplasms metastasis Endothelial growth factors

肝腫瘤/病理學 巨噬細胞 腫瘤轉移 內皮生長因子

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.005