菌種保藏方法研究

鐘 杰，左澤彥

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽 550016)

現階段，越來越多的菌種被人們發現并運用到食品、醫療、化工等各個領域。隨著對菌種的深入研究和運用，人們逐漸發現菌種和現代人們的生活息息相關。為了使從自然界分離得到的優質菌株能夠得以持久利用，菌種的保藏方法必然成為研究的重點，這樣才能使具有優質性能的菌株最大程度的發揮作用，更為重要的是在菌種保藏過程中菌種原有的特性不會改變或改變很小，這對微生物的研究具有極大促進作用。

世界各國非常重視微生物菌種的保藏工作。菌種保藏研究始于1890年，但直到1906 年，各國才相繼建立了菌種保藏機構。相比，中國的菌種保藏機構于20世紀50年代才開始建設， 直到1979 年正式成立6 個專業性保藏管理中心[1]。研究和選擇一種適宜的保藏方法成為各國學者研究的重要工作[2]。

1 菌種保藏的原理

菌種保藏的原理是根據菌種特有的生理生化特性，人為制造低溫、干燥、缺氧的環境使菌種保持原有的性狀不發生變異或變異很小，終止其繁殖，使代謝降到最低，從而達到半休眠，甚至是完全休眠的狀態。對菌種進行保藏的最終目標就是降低菌種的死亡、變異、污染，保持菌種的活性[3]。

2 常用的菌種保藏方法

2.1 定期移植法

定期移植也叫繼代保藏法，就是將菌種接種到適合生長的培養基上生長至成熟或產生孢子時，做好標記和記錄，放置于低溫2～10℃，實驗室通常放置于4℃冰箱進行短期的菌種保藏。

定期移植法是當前實驗室使用最多的短期保藏菌種的方法。

2.2 甘油法

甘油法是在無菌環境中利用無菌生理鹽水將菌種制備成菌懸液，再用濃度為40%～50%甘油經滅菌處理后作為保護劑，保護菌種在凍融過程中不破壞原生質層和細胞膜，菌液和甘油等量加入到滅菌的離心管中，做好標記和記錄，放置與-20℃冰箱或-80℃超低溫冰箱，可保藏3～5年，柳洪潔[4]對甘油保藏法進行了改良，用滅菌的肉湯代替生理鹽水制備菌懸液，取得了更好的保藏效果。甘油保藏法是實驗室進行長期保存菌種的主要方法之一。雖然定期移植方法簡單，但需要經常移植，移植的過程中會發生染菌、變異等問題，所以長期保藏菌種可采用甘油法。

2.3 干燥保藏法

干燥保藏法也叫載體保藏法，是利用各種方法將菌種吸附在載體上，將菌種用來生長繁殖的水分除去，使菌種代謝將至最低變為休眠狀態，但又能保持菌種原有的特性。根據載體不同，干燥保藏法主要有沙土管保藏法、濾紙保藏法、明膠片保藏法、硅膠保藏法、麩皮保藏法等。其中沙土管保藏法、濾紙保藏法、明膠片保藏法使用最多，以下以沙土管保藏法說明。

取河沙與黃土經過多次的過篩處理，用酸去除有機質，然后用純化水沖洗至中性，烘干備用。按照沙與土3∶2的比例混合放在沙土管中，進行2～3次的高溫滅菌，將要保藏的菌種或孢子放于沙土管中，用真空機抽干管內的水分，放于4℃冰箱可保藏5～7年。

2.4 冷凍干燥保藏發

冷凍干燥也叫冷凍真空干燥保藏法。主要步驟是將菌種制成懸浮液，加入保護劑(如甘油)，在-45℃左右的低溫環境中快速冷凍，然后在真空減壓環境中使水分升華，從而營造一個不宜菌種生長而又能長期保藏的環境。

冷凍干燥保藏法是專業機構保藏菌種使用最多的的方法。該種方法結合了多種保藏菌種的特點，將保藏環境控制在低溫、缺氧、干燥狀態，同時還添加保護劑減少了在保種對菌種的傷害，多重有利的環境因素抑制了菌種的生理活動，使菌種處于休眠狀態，這種方法適用于絲狀真菌、細菌、放線菌、病毒等，保藏時間可達10～20年，甚至更久的時間。

2.5 液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏法是將需要保藏的菌種和保護劑按一定的比例放于凍存管中，再將凍存管保藏在(-196～-150℃)的超低溫液氮中，常用的保護劑有甘油、血清蛋白、二甲基亞礬、聚乙烯氮戊環、糊精、吐溫80 等，不同的菌種要根據自己的特性選擇不同的保護劑。

液氮超低溫保藏法是國際上保藏菌種常用的方法，是目前保藏菌種最理想的方法。在超低溫環境中菌種喪失了代謝功能，保持了菌株原有的性狀，變異的可能性也大大降低，這種方法對大部分菌株都適用，且保存時間長達5～8年。

表1 常用菌種保藏方法優缺點

3 菌種退化的原因及復壯措施

3.1 菌種退化

菌種在長期的保藏中受外界因素或自發突變造成菌種某些優良性能的衰退，稱為菌種退化。菌種退化嚴重影響菌種的特性和質量，了解和掌握菌種退化的原因和復壯措施是為了保持菌種的優良性狀及生活力強的特性。

3.2 菌種退化的原因

導致菌種的退化的因素有很多，有自發突變，也有外界因素的影響。主要因素有遺傳物質變異、基因突變、培養環境不適、保藏方法不當、菌種混雜、病毒感染等等。

3.3 復壯措施

在長期的保藏過程中，菌種因多種因素的影響，變異和衰退的現象時有發生，為了維持或恢復菌種原有的優良性狀，通常都要給菌種進行復壯處理。常用的菌種復壯的方法主要有菌種純化、更換適宜的培養基、菌絲尖端分離、控制菌種的傳代次數及采用適宜的保藏方法等。下面對各種復壯措施進行介紹。

菌種純化：為了使菌種復壯，菌種純化是常用的一種復壯方法。原理是定期分離菌種，將退化的菌種分離出來，挑選出具有優良性狀的菌株在適宜的培養基上培養，恢復菌種原有的生長發育，再而進行擴大培養[5]。

更換適宜的培養基：菌種在培養過程中因為代謝物的增加，導致生長環境的改變，菌種長期處于不利環境時就會出現退化，更換適宜的培養基就有可能使菌種恢復原有的生長狀態。該方法是最簡單使菌種復壯的方法，但對很多退化的菌種不適合。

菌絲尖端分離：挑取健壯菌絲體頂端部分，進行純化培養，以保持菌種的純度，使菌種恢復原來的生活力和優良種性，達到復壯的目的[6]。

控制菌種的傳代次數：菌種在多次傳代過程中會發生少量基因的突變，到突變達到一定程度時，就會造成遺傳物質的改變，然而頻繁無性繁殖一般都是負變異占絕對優勢[7]。因此，控制菌種的傳代次數也是防止菌種退化和維持原有性狀的有效措施之一。

采用適宜的保藏方法：菌種在保藏過程中，由于方法不當會使菌種生理、生化發生改變，導致代謝減弱或混亂，從而發生菌種退化。對于這種情況，采用合適的保藏方法將會使菌種再次恢復到原有狀態，使菌種復壯。

4 討論

由于菌種的特性不同及菌種保藏方法的優缺點各異，因此，在選擇菌種保藏方法時應充分考慮菌種的特性、保藏的目的、實驗室設施條件及經濟效益，選擇最適宜的菌種保藏方法。選擇合理的菌種保藏方法，充分維持菌種的活性及純度，才能發揮菌種應有的價值，提高科研的可信度，與此同時，掌握菌種退化的原因和復壯的措施，避免菌種在長期的保藏過程中丟失原有的優良性狀。

[1]顧金剛,姜瑞波. 微生物資源保藏機構的職能、作用與管理舉措分析[J].中國科技資源導刊,2008,40(5):53-57.

[2]穆 婷,封艷艷,宋 珉,等. 藥品微生物檢驗用菌種保藏方法簡論[J]. 母嬰世界,2015,3(6):361-362.

[3]劉文麗,程 池,姚 粟,等. 韓國食品用微生物菌種管理現狀[J].食品與發酵工業,2015,41(11):237-242.

[4]柳洪潔. 動物微生物學實驗菌種保藏與管理[J].實驗科學與技術,2014,12(3):26-28.

[5]赫朝燦.菌種退化的原因、處理措施及菌種保藏探析[J].生物技術世界,2015(2):1.

[6]佚 名.菌種保藏方法及復壯技術[J].吉林蔬菜,2017(6):34-35.

[7]李 紅,肖千明，劉 娜，等. 食用菌菌種退化原因分析及復壯方法的探討[J]. 遼寧農業科學2010(5)：57-59.

(本文文獻格式：鐘杰，左澤彥.菌種保藏方法研究[J].山東化工,2018,47(7):60-61.)