發酵液中乙醇含量的測定方法

李嶺卓，李 銳，熊小毛，楊團員，張明春，還 萍，馬向東

（1.湖北大學生命科學學院，生物資源綠色轉化湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430062；2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋 434200）

在釀酒相關研究和生產中，常涉及乙醇含量的測定。乙醇含量測定的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、生物傳感器法[1-2]、密度瓶法、酒精計法、重鉻酸鉀比色法等[3]。這些方法中，密度瓶法、酒精計法需要對樣品進行蒸餾，操作較為繁瑣；液相色譜法需要用示差折光檢測器，一般實驗室不具備，或者需對樣品進行柱前衍生化[4]，操作也較為復雜；氣相色譜法[5]準確度高，但存在儀器昂貴、操作復雜、測定時間長等缺點；生物傳感器法操作方便、測定準確，不過存在價格較高、設備不普及等不足。

相比較而言，重鉻酸鉀比色法操作較簡單，能同時測定多個樣品，不需要特殊儀器，一般實驗室均能進行。其原理：在酸性條件下重鉻酸鉀與乙醇反應生成三價鉻離子（Cr3+），而Cr3+在590 nm[6]處有吸收峰，可以利用吸光度值計算溶液中的乙醇含量。

在發酵液中，除乙醇外還含有其他還原性物質可以與重鉻酸鉀反應[7]，也會生成Cr3+，使得測定結果偏大。為了排除還原性物質的干擾，本研究用煮沸、補水的方式除去發酵液中的乙醇，將原發酵液和除去乙醇的發酵液都與重鉻酸鉀反應，得到兩個吸光度，則兩個吸光度之差（前者減去后者）可以表示乙醇的實際含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：實驗中用的哈爾濱小麥王啤酒、波爾多騎士紅葡萄酒購于超市；12 h、24 h、48 h的釀酒酵母YPD發酵液實驗室自備。

乙醇標準溶液（10 g/L）：分析純無水乙醇10 g，蒸餾水定容至1 L。

YPD溶液：酵母粉5 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L，108℃滅菌20 min。

重鉻酸鉀溶液：稱取50 g重鉻酸鉀（分析純）溶于500 mL水中，加100 mL濃硫酸，冷卻，蒸餾水定容至1 L。

儀器設備：SectraMax M2酶標儀，Molecular Devices公司；M-100生物傳感器，深圳西爾曼科技有限公司；微波爐；電爐；水浴鍋；電子天平等。

1.2 試驗方法

1.2.1 重鉻酸鉀比色法標準曲線

取乙醇標準溶液，用蒸餾水稀釋成乙醇濃度分別為0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L的樣品溶液。在15 mm×15 cm的試管中，分別加入5 mL樣品溶液、2 mL蒸餾水和3 mL重鉻酸鉀溶液，加試管塞，沸水浴10 min，流水冷卻至室溫，取200 μL反應液至酶標板中，用酶標儀測定其在590 nm處的吸光度。以吸光度為橫坐標，乙醇濃度（g/L）為縱坐標，作標準曲線。

1.2.2 煮沸方式與時長的探索

探究微波爐和電爐兩種煮沸方式，1 min、2 min、3 min 3個煮沸時長對乙醇殘留量的影響。

1.2.3 操作過程

操作流程見圖1。發酵液用蒸餾水稀釋合適的倍數，使稀釋后乙醇濃度在0.2～1.4 g/L之間，得待測液Ⅰ。取10 mL待測液Ⅰ加入50 mL錐形瓶中，稱重，記錄重量，微波爐或電爐煮沸2 min（沸騰后開始計時），冷卻，將錐形瓶放在天平上，補加蒸餾水至原重量，得待測液Ⅱ。

按5 mL待測液+2 mL蒸餾水+3 mL重鉻酸鉀溶液的體系反應，測吸光度（操作參照1.2.1）。將吸光度Ⅰ與吸光度Ⅱ之差帶入線性方程，再乘以稀釋倍數，即可以計算出發酵液中的乙醇含量。

圖1 操作流程

1.2.4 煮沸對YPD溶液的影響

取YPD溶液，蒸餾水稀釋15倍，得YPD待測液。取部分YPD待測液煮沸、補水，將煮沸前的YPD待測液和煮沸、補水后的YPD待測液分別與重鉻酸鉀反應，測吸光度。

1.2.5 回收率及精密度實驗

取2 g無水乙醇，用YPD溶液定容至100 mL。將該溶液用蒸餾水稀釋15倍，按1.2.3的方法，測定溶液中乙醇的含量，做6個平行。

1.2.6 發酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇濃度的測定

取12 h、24 h、48 h的釀酒酵母YPD發酵液。發酵液均稀釋10倍，葡萄酒稀釋100倍，啤酒稀釋25倍。按1.2.3的方法，測定各樣品中乙醇含量，各做3個平行。同時用生物傳感器測定各樣品中乙醇含量，作為參照。

2 結果與分析

2.1 標準曲線（圖2）

圖2 重鉻酸鉀標準曲線

從圖2可看出，乙醇濃度在0.2～1.4 g/L的范圍內與吸光度線性關系良好，線性回歸方程為y=6.8141x+0.0365（R2=0.9993），其中x是吸光度值，y是乙醇濃度。則乙醇濃度計算公式為：乙醇濃度（g/L）=[（吸光度Ⅰ-吸光度Ⅱ）×6.8141+0.0365]×稀釋倍數。

2.2 煮沸方式及時長的探索結果

煮沸方式和時長對殘留乙醇濃度的影響見表1。由表1可知，兩種煮沸方式均可。煮沸時長2 min及以上時，發酵液中的乙醇基本完全揮發，故選定煮沸時長為2 min。

表1 煮沸方式和時長對殘留乙醇濃度的影響

2.3 煮沸對YPD的影響（表2）

表2 煮沸對YPD溶液的影響

由表2可知，煮沸前的YPD待測液與重鉻酸鉀反應所得的吸光度，和煮沸、補水后的YPD待測液與重鉻酸鉀反應所得的吸光度幾乎沒有差別。說明煮沸不會使YPD溶液中的還原性物質與重鉻酸鉀反應的能力發生變化。

2.4 回收率及精密度實驗結果（表3）

由表3可知，在YPD溶液中添加20 g/L的乙醇，本法回收率為98.58%～102.14%，相對標準偏差（RSD）為1.52%（n=6），說明本法精密度良好。

2.5 發酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇濃度的測定結果（表4）

如表4所示，用本法測定了5個樣品的乙醇含量。經t檢驗，本方法所得結果與生物傳感器所測得的結果均沒有顯著差異，p＞0.05。本方法與生物傳感器法的差異為0.36%～1.74%,說明本方法準確度良好。

表3 回收率及精密度試驗結果

表4 發酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇濃度測定的結果

3 討論

本方法能準確地測定發酵液中的乙醇含量。檢測的精密度、準確度、回收率等各項指標均達到分析要求。本法還能測定葡萄酒、啤酒等有色酒中的乙醇含量。

筆者在進行釀酒微生物相互作用的研究中，涉及發酵液中乙醇含量的測定，結合實驗室條件和有大量樣品需要測定的實際需求，建立了本測定方法。本方法可以同時處理多個樣品，不需要像氣相色譜法和液相色譜法那樣依次進樣，也不需要像密度瓶法、酒精計法那樣依次蒸餾，當樣品量多時，本方法能節省大量檢測時間。

限于本方法的原理，目前不能排除甲醇、丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等揮發性醇類對實驗結果的干擾，不過釀酒相關實驗和生產中所涉及的發酵液的乙醇含量遠遠高于其他揮發性醇，所以本方法適用于釀酒相關實驗和生產。本方法不需要昂貴的儀器設備，成本低廉，可以得到廣泛的應用。

參考文獻：

[1]馮東,王丙蓮,梁曉輝,等.生物傳感器法快速測定酒中的乙醇含量[J].釀酒科技,2012(2)：83-86.

[2]趙洪慶,高紅波,鐘其頂,等.乙醇傳感器法測定葡萄酒和黃酒中乙醇的含量[J].食品工業科技,2014,35(19)：293-296.

[3]牟建樓,王頡,張偉,等.乙醇的測定方法綜述[J].釀酒,2006(2)：46-48.

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