血清對大鼠星形膠質細胞形態和水通道蛋白-4表達的影響

賈 梅，師忠芳，王玉嬌，閆 旭，徐立新，董麗萍，李佳欣，陳 燁，袁 芳

首都醫科大學北京市神經外科研究所病理生理室，首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京市100050

腦水腫是腦外傷后嚴重的并發癥，常常危及生命[1]。星形膠質細胞上的水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP-4)是腦內最豐富的水通道蛋白，主要維持細胞內外水平衡，在外傷性腦水腫的病理生理過程中發揮重要作用[2-4]。現有研究顯示，在不同類型的腦外傷模型中，AQP-4表達增高或降低[5-9]。不同原因引起的腦外傷均導致血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)功能障礙[1]，漏出到腦組織間隙的血清蛋白是否對AQP-4表達有影響目前并不清楚。整體實驗存在多種組織細胞之間的相互作用，無法觀察單一因素引起的變化，故本實驗應用無血清培養基中添加血清的方法模擬BBB功能障礙，離體水平觀察血清對培養星形膠質細胞形態及AQP-4表達的直接影響，旨在明確BBB破壞對AQP-4表達的影響，為更好地理解AQP-4在外傷性腦水腫中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生24 h內的雌性Wistar大鼠，由軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK-(軍)2012-0004。實驗過程按照實驗動物使用“3R”原則給予人道關懷，所有實驗操作通過北京市神經外科研究所倫理委員會審查。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗儀器

Light Cycler480實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)儀：瑞士ROCHE公司。Observer A1倒置熒光顯微鏡：德國ZEISS公司。5415R高速離心機：德國EPPENDORF公司。CB150三氣細胞培養箱：德國BINDER公司。

1.2.2 實驗試劑

DMEM培養基(11966025)、NB培養基(A2477501)、丙酮酸鹽溶液(11360070)、Glutamax溶液(35050061)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(10099-141)：美國THERMO FISHER公司。牛胰島素(I5500)、肝素-表皮生長因子(E4643)、腐胺(P5780)、轉鐵蛋白(T1147)、N-乙酰-L-半胱氨酸(A8199)、亞硒酸鹽(S5261)、多聚賴氨酸(P1524)：美國SIGMA公司。血清白蛋白(HY-D0842)、孕酮(HY-N0437)：美國MEDCHEM EXPRESS公司。

兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(Z0334)：丹麥DAKO公司。小鼠抗大鼠AQP-4抗體(ab9512)：美國ABCAM公司。兔抗大鼠代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)抗體(ab76316)：美國ABCAM公司。Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔二抗(A1108)、Alexa Fluor 546標記的山羊抗小鼠二抗(A1103)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)：美國THERMO FISHER公司。抗熒光淬滅封片劑(ZLI-9556)：北京中杉金橋生物技術有限公司。總RNA提取試劑盒(LS1040)、反轉錄試劑盒(A3500)：美國PROMEGA公司。SYBR GreenⅠ核酸染色試劑盒(04887352001)：瑞士ROCHE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞原代培養

細胞培養參考本課題組已發表的方法[10]并進行改良。出生24 h內雌性Wistar大鼠乙醚麻醉后取大腦皮層，剝除腦膜后用解剖刀切碎成1 mm3組織塊，加入DMEM培養基并制成細胞懸液。200目濾網過濾后，血球計數板計數。調整細胞密度，按照1.2×105/cm2接種到已包被多聚賴氨酸的培養板或培養瓶中，15 min后將上清取出，添加新鮮無血清培養基或者有血清培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

無血清培養基(serum free medium,SFM)配方參考文獻[11]并進行改良，主要成分為DMEM培養基和NB培養基，添加丙酮酸鹽、Glutamax、牛胰島素、肝素-表皮生長因子、腐胺、轉鐵蛋白、N-乙酰-L-半胱氨酸、亞硒酸鹽、血清白蛋白、孕酮。有血清培養基分別為DMEM培養基加10%FBS(DMEM+FBS)、上述無血清培養基加10%FBS(SFM+FBS)。

1.3.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態

細胞分別在SFM、DMEM+FBS及SFM+FBS培養基中培養7 d，每天在倒置相差顯微鏡下觀察培養細胞形態并拍照。

1.3.3 細胞免疫熒光染色

培養細胞免疫熒光染色方法參考文獻[10]。原代培養7 d后，丙酮固定，先后進行山羊血清避光封閉20 min、一抗4℃過夜孵育、二抗室溫孵育2 h、DAPI復染后，抗淬滅的封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。抗體濃度如下：GFAP(1∶50)、AQP-4(1∶200)、mGluR5(1∶200)一抗，山羊抗兔/小鼠二抗(1∶200)。陰性對照使用PBS代替一抗。

1.3.4 圖像分析

應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對細胞免疫熒光結果進行圖像分析[12]。每組取3個樣本，每個樣本在鏡下(200×)隨機選取3個非重疊視野，計算每個視野的積分光密度值(integrated optical density,IOD)。以9個視野中免疫反應陽性細胞的平均IOD代表目標蛋白的表達水平。

1.3.5 RT-qPCR

逆轉錄RT-qPCR方法參考文獻[10]。細胞原代培養7 d后，提取總RNA并進行反轉錄，隨后進行PCR擴增。GFAP、AQP-4及mGluR5引物由深圳華大基因科技服務有限公司設計合成。引物序列見表1。

表1 上下游引物序列

PCR 反 應體系構成(20 μl)：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，無核酸酶的水 7 μl，模板 cDNA 1 μl，上、下游引物各1 μl。PCR反應共40個循環，條件如下：95℃預熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。使用LightCycler480實時PCR儀進行實驗，LightCycler480 1.5.0軟件分析熒光信號，以 β-actin 為內參，GFAP/β-actin，AQP-4/β-actin 及mGluR5/β-actin分別表示星形膠質細胞GFAP、AQP-4及mGluR5的mRNA表達水平。

1.4 統計學分析

應用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以表示。星形膠質細胞GFAP、AQP-4及mGluR5在蛋白水平和mRNA水平的比較均采用單因素方差分析及最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD)。顯著性水平α=0.05。每組實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 星形膠質細胞的形態

GFAP是星形膠質細胞標志物[13]，GFAP細胞免疫熒光染色結果表明，SFM、DMEM+FBS及SFM+FBS中的細胞免疫熒光染色均為陽性，證實為星形膠質細胞。星形膠質細胞在SFM中細胞折光性強，細胞核和胞體較小，細胞突起細長；在DMEM+FBS及SFM+FBS中，細胞折光性弱，呈多角扁平形，細胞突起短小，細胞核和胞體較大。見圖1。

2.2 GFAP、AQP-4蛋白表達

不同培養基培養的星形膠質細胞GFAP和AQP-4蛋白水平有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，mGluR5水平無顯著性差異(P＞0.05)。DMEM+FBS和SFM+FBS中GFAP和AQP-4蛋白水平均顯著低于SFM(P＜0.001)。見圖2、表2。

2.3 GFAP、AQP-4 mRNA表達

不同培養基培養的星形膠質細胞GFAP和AQP-4 mRNA水平有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，mGluR5 mRNA水平無顯著性差異(P＞0.05)。DMEM+FBS和SFM+FBS中GFAP和AQP-4的mRNA水平均顯著低于SFM(P＜0.001)。見表3。

圖1 各組GFAP免疫熒光染色(200×，bar=50 μm)

圖2 各組GFAP、AQP-4及mGluR5免疫熒光染色(200×，bar=50 μm)

表2 不同血清培養的星形膠質細胞GFAP、AQP-4和mGluR5蛋白水平比較

表3 不同血清培養的星形膠質細胞GFAP、AQP-4和mGluR5 mRNA水平比較

3 討論

腦外傷后首先出現BBB破壞所致的血管源性腦水腫，然后出現繼發性的細胞毒性腦水腫[14]。在BBB功能障礙的病理情況下，滲出到血管外的血清是否對星形膠質細胞AQP-4表達有影響，目前并不清楚。本研究利用培養的星形膠質細胞發現，星形膠質細胞的形態、GFAP及AQP-4表達水平在無血清及有血清培養基中均不一致，同時設立的對照實驗顯示，無血清培養基添加FBS引起的星形膠質細胞形態變化、GFAP及AQP-4表達變化與有血清培養基相似，即星形膠質細胞形態由胞體小突起長變為胞體大突起短，同時GFAP及AQP-4表達降低，說明FBS直接改變星形膠質細胞形態、降低GFAP及AQP-4的表達。許多研究表明，在血管源性腦水腫中，星形膠質細胞AQP-4表達減少促進腦水腫的形成[14-15]；本研究結果提示，腦外傷后BBB功能障礙引起的AQP-4表達降低，促進外傷性腦水腫的進展。

尸檢及動物模型中均發現，腦外傷后星形膠質細胞出現水腫、肥大等形態改變[16]。我們的離體實驗結果顯示，培養基中添加血清后星形膠質細胞的胞體及細胞核均變大，細胞突起變短，這與腦外傷后腦組織標本中所見的星形膠質細胞形態相似。Foo等[17]及Zhang等[18]也報道，血清引起培養星形膠質細胞形態出現同樣的變化。GFAP是星形膠質細胞主要的中間絲蛋白[19]，在維持星形膠質細胞的結構和功能方面發揮重要作用[20]。本研究還發現血清降低星形膠質細胞GFAP的表達。本研究結果提示，在BBB破壞的病理情況下，血清蛋白是引起星形膠質細胞形態及功能改變的因素之一。

AQP-4在外傷性腦水腫中發揮重要作用。Kiening等[14]報道，在外傷性腦水腫模型中檢測到AQP-4表達減少。Papadopoulos等[15]發現AQP-4基因敲除促進血管源性腦水腫模型的進展。本實驗發現，在培養基中添加血清引起AQP-4表達降低。前期實驗表明，細胞劃痕損傷降低培養星形膠質細胞的AQP-4表達[21]，因此我們的離體實驗結果提示，腦外傷的直接損傷以及BBB破壞導致的血清蛋白漏出均直接導致AQP-4表達降低。在外傷性血管源性腦水腫中，組織內多余的水來自于BBB通透性增加，而非AQP-4介導的水轉運，因此，血管源性腦水腫中AQP-4的減少導致星形膠質細胞調節水平衡能力下降，無法將組織內多余的水排出，加重腦水腫[15]。但是也有研究發現，在外傷性腦水腫模型中AQP-4表達增加[22-23]。現有實驗中觀察到的AQP-4表達變化不同，一方面可能與腦外傷模型的種類、損傷嚴重程度和損傷時間長短有關，另一方面可能與腦外傷后腦組織分泌多種炎癥因子和凝血因子[24-25]、機體微環境發生復雜變化有關[26]。本研究在離體水平模擬研究BBB破壞后血清對星形膠質細胞AQP-4表達的影響，但是血清成分復雜，具體何種成分降低AQP-4表達仍有待進一步研究。

mGluR5是腦內興奮性神經遞質谷氨酸的代謝型受體中的一種亞型，在星形膠質細胞和神經元上均有表達[27]。蔡英等[9]在液壓打擊顱腦損傷模型中發現，腦外傷引起mGluR5表達減少。前期研究發現，星形膠質細胞上mGluR5參與谷氨酸引起AQP-4表達變化的調節[28]，但是本研究未觀察到血清對mGluR5表達的影響。目前mGluR5與AQP-4表達的關系及其在外傷性腦水腫中的作用研究很少，還有待深入探討。

綜上所述，本研究在無血清培養基中添加血清，部分模擬了腦外傷后BBB功能障礙的情況，發現血清直接改變星形膠質細胞形態和GFAP表達，并引起AQP-4的表達降低，因此可能促進血管源性腦水腫的發展，為更好地理解AQP-4在外傷性腦水腫中的作用提供了新的實驗依據。最新研究發現促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)可以通過恢復BBB結構和功能的完整性、阻止AQP-4表達降低而發揮治療外傷性腦水腫的作用[29]。因此，以BBB及AQP-4為治療靶點的研究將為外傷性腦水腫的臨床治療提供新的線索及方法。

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