lQGAP1誘導肝細胞肝癌干性促進血管生成擬態(tài)形成的實驗研究*

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中國較為常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人民的健康［1］。目前，針對HCC的治療手段主要是手術切除和肝移植。肝癌肝移植的總體療效優(yōu)于手術切除，但是肝移植的發(fā)展局限于現階段移植器官的不足［2-3］。由于HCC的高侵襲性和高轉移性，患者的復發(fā)率較高，預后較差，死亡率較高。因此，尋找有效的方法評估患者的預后和生存情況至關重要。近年來的研究表明，HCC的發(fā)生、發(fā)展和轉移機制相當復雜，其中腫瘤血管生成和血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）起著重要作用。VM是一種管壁由腫瘤細胞圍成，不依賴機體內皮細胞的腫瘤微循環(huán)模式。腫瘤細胞模仿機體血管生成而形成瘤細胞條索并圍成管道，而血液則在這無內皮細胞的管道中流動。具有VM的腫瘤惡性度較高，生長迅速且轉移率高［4-5］。

具有IQ結構域的GTP激酶活化蛋白1（IQ-motif containing GTPase activating protein 1，IQGAP1），是新近發(fā)現的一種Ras GTP酶活化蛋白質，是Rho家族成員Racl和cdc42的一個重要效應因子［6-7］。IQGAPl能夠參與多種細胞的分子生物學功能，包括細胞骨架重塑、細胞黏附、細胞增殖、細胞分化等［8-10］。IQGAP1在許多腫瘤中高表達，并對腫瘤細胞的侵襲、增殖和血管生成等方面存在明顯的促進作用［11-12］。

目前，IQGAP1與VM的形成以及其促進HCC發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確，本研究旨在通過調控IQGAP1在HCC中的表達，研究其促進VM發(fā)生發(fā)展的機制，并為HCC的治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2001年1月至2009年1月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院存檔的HCC手術切除標本180例，病理診斷為原發(fā)性HCC，并且隨訪資料完整。全部病例均為手術標本且患者術前未行放化療，組織標本及病例資料的使用均經天津醫(yī)科大學倫理委員會審查批準。

1.1.2 細胞株 人肝癌細胞株Bel7402、SMMC7721、MHCC97L和HepG2細胞系（均購自美國ATCC公司）。

1.1.3 主要試劑 MEM、RPMI-1640培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基（購自美國Neuronbc公司），胎牛血清（購自美國Gibco公司）。質粒及慢病毒包裝試劑盒（購自美國Genecopoeia公司）：IQGAP1過表達質粒（EX-E0228-Lv201），IQGAP1過表達對照質粒（EX-NEG-Lv201），IQGAP1降表達質粒（HSH021588-LVRU6MP），IQGAP1降表達對照質粒（CSHCTR001-LVRU6MP），慢病毒包裝試劑盒（203WUO501）。Matrigel膠（購自美國Invitrogen公司）。IQGAP1抗體（購自美國Abcam公司，ab133490），CD133（購自美國Biorbyt公司，orb9913），CD44（購自美國Abcam公司，ab119863），Sox2（購自美國GeneTex公司，GTX101507），ALDH1（購自美國Abcam公司，ab23375），GAPDH（購自美國Santa Cruz公司，Sc25778）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色采用PV6000試劑盒。所有標本均為石蠟包埋組織，5 mm厚切片，經脫蠟水化，3%H2O2封閉內源性過氧化酶，微波熱修復，血清封閉，一抗4℃孵育過夜。次日滴加二抗孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染核，封片。

1.2.2 CD31與PAS雙重染色 常規(guī)染完CD31后，將組織切片置于過碘酸鈉中10 min，蒸餾水洗2次，然后滴加雪夫試劑15 min，置于37℃孵箱避光反應15 min，自來水沖洗20 min，蒸餾水洗2次，蘇木素復染核、封片。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系HepG2，SMMC7721培養(yǎng)于37℃，5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱。HepG2培養(yǎng)基為MEM+10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）+1%非必需氨基酸+1%丙酮酸鈉；SMMC7721培養(yǎng)基為RPMI-1640+10%FBS+1%雙抗。

1.2.4 細胞轉染 在6孔板中培養(yǎng)細胞，轉染前1天換滅活血清培養(yǎng)，培養(yǎng)至合適濃度后，每孔添加1 mL病毒液+1 mL培養(yǎng)基+10 mL Polybrene，12 h換成含血清的完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，熒光觀察轉染效率，嘌呤霉素藥篩。

1.2.5 Western blot法 將提取的蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，PVDF膜轉膜90 min。在5%脫脂奶粉中室溫封閉 1 h，添加抗體 IQGAP1（1：5 000），CD133（1：500），CD44（1：500），Sox2（1：500），ALDH1（1：200），GAPDH（1：1 000），4℃孵育過夜，次日恢復室溫后與二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗PVDF膜，加入發(fā)光液，顯影，照相。蛋白條帶的灰度定量分析采用Image J軟件處理。

1.2.6 細胞遷移侵襲實驗 侵襲實驗前1天在Transwell小室中加入30 mL Matrigel膠，遷移不鋪膠，放置于24孔板中，于培養(yǎng)箱中過夜。采用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，調整細胞密度至1×105個/mL，于小室上層加入200 mL細胞懸液，下層加入500 mL含血清的完全培養(yǎng)基，遷移實驗培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，侵襲實驗48 h后取出，用冷甲醇固定，0.4%結晶紫染色，于倒置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計數據。

1.2.7 平板克隆形成實驗 細胞重懸調整細胞濃度至103個/mL，六孔板內每孔吸取50 mL細胞懸液，補加培養(yǎng)液至2 mL，搖勻，常規(guī)培養(yǎng)2～3周，當出現肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，顯微鏡觀察照相。甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min，自來水沖洗晾干照相。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。應用χ2檢驗分析IQGAP1蛋白和臨床病理特點的關系。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，分析IQGAP1對HCC預后的價值。計量資料采用t檢驗分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IQGAP1的表達及其與VM、肝癌患者臨床病理資料的關系

免疫組織化學染色后IQGAP1陽性呈棕黃色，定位于細胞膜、細胞質（圖1）。CD31/PAS雙染結果顯示，內皮依賴性血管是由CD31陽性的血管內皮細胞圍成，管腔內可見紅細胞；VM則由腫瘤細胞圍成的管腔樣結構，PAS陽性物質襯覆，管腔內存在紅細胞（圖2）。

在180例HCC病例中，IQGAP1陽性率為59.4%（107/180）。統(tǒng)計學分析顯示IQGAP1的表達與年齡、性別、腫瘤直徑無關，而與腫瘤分級、轉移、VM相關（表1）。在107例IQGAP1陽性的病例中，VM的陽性率為35.5%（38/107）；在73例IQGAP1陰性的病例中，VM的陽性率為13.7%（10/73）。生存分析顯示，IQGAP1陽性患者較IQGAP1陰性患者的生存時間短，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=7.889，P=0.005，圖3）。

圖1 IQGAP1在HCC中的表達定位于細胞膜、細胞質（IHC×200）

圖2 不同IQGAP1表達水平的HCC組織中VM與血管生成情況（IHC×400）

2.2 IQGAP1對細胞生物學行為的影響

比較Bel7402、SMMC7721、MHCC97L和HepG2 4種細胞系中IQGAP1的表達。結果顯示，HepG2細胞IQGAP1蛋白表達水平最低，而SMMC7721細胞IQGAP1蛋白表達水平最高（圖4）。將IQGAP1上調質粒及上調對照質粒轉入HepG2細胞，將IQGAP1下調質粒及下調對照質粒轉入SMMC7721細胞。細胞轉染以后，以HepG2 IQGAP1、SMMC7721 shIQGAP1為實驗組，各自對照組為HepG2對照組和SMMC7721對照組。各實驗組與對照組進行比較，得出下述結果。遷移侵襲實驗結果顯示：在遷移實驗中，HepG2細胞上調IQGAP1后，與對照組相比，穿過小室的細胞數增多，SMMC7721細胞下調IQGAP1后，與對照組相比，穿過小室的細胞數減少。在侵襲實驗中，HepG2對照組細胞僅能穿過5個細胞，上調IQGAP1后，穿過的細胞個數是對照組的4倍，SMMC7721實驗組與對照組相比，穿過的細胞數明顯減少。兩部分的實驗結果表明，IQGAP1可以增強HCC細胞的遷移侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。

表1 lQGAP1的表達與肝細胞肝癌臨床病理特征的關系

圖3 IQGAP1陽性患者與IQGAP1陰性患者的生存期比較

平板克隆形成實驗結果顯示，HepG2對照組與HepG2 IQGAP1細胞均能形成克隆，而HepG2 IQGAP1組的克隆數量明顯多于HepG2對照組，HepG2 IQGAP1組的克隆大小是HepG2對照組克隆大小的兩倍。SMMC7721對照組與SMMC7721 shIQGAP1組相比，shIQGAP1組的克隆數量比對照組明顯減少，shIQGAP1組的克隆大小明顯＜對照組。結果表明，IQGAP1可以增強HCC細胞增殖能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖6）。

圖5 過表達IQGAP1對HepG2細胞侵襲能力的影響和降表達IQGAP1對SMMC7721細胞侵襲能力的影響

三維培養(yǎng)結果顯示：HepG2細胞不具有形成三維管道的能力，而IQGAP1上調以后，出現了明顯的管道樣結構。SMMC7721本身能夠形成三維管道，而下調其IQGAP1的表達以后，三維管道形成能力明顯削弱。結果表明，IQGAP1可以增強HCC細胞三維成管的能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖7）。

2.3 IQGAP1的升高增強了HCC干性相關蛋白的表達

使用Western blot法檢測轉染后HepG2、SMMC7721細胞中CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表達情況。結果顯示，在HepG2細胞上調IQGAP1以后，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表達明顯升高，在SMMC7721細胞中下調IQGAP1以后，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表達明顯降低（P＜0.05，圖8）。

圖6 IQGAP1對HCC的增殖能力的影響

圖7 IQGAP1對HCC細胞管道形成能力的影響

圖8 Western blot法檢測相關蛋白的表達變化

細胞免疫熒光顯示,在HepG2細胞中，上調IQGAP1的表達，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表達增高，而在SMMC7721細胞中，下調IQGAP1的表達，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表達降低。結果表明，隨著IQGAP1的升高，HCC細胞的干性相關蛋白表達也增強（圖9）。

圖9 細胞免疫熒光檢測干性相關蛋白的變化（Immunofluorescence×200）

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個長期、多階段、多重基因突變的復雜過程［13］。癌細胞的無限增殖和轉移是較為重要的腫瘤惡性生物學行為，腫瘤的生長需要營養(yǎng)的供給，血管形成是腫瘤轉移的基礎［14］。多數癌癥患者死于腫瘤的復發(fā)和轉移，導致死亡的原因主要是腫瘤轉移直接侵犯器官、副腫瘤綜合征和（或）治療引起的并發(fā)癥，因此明確腫瘤的復發(fā)尤其是轉移機制，可以為腫瘤的預防和治療提供一些新的思考方向和治療策略。

IQGAP1是一種分子量為189 kD的細胞骨架蛋白，主要在腫瘤細胞的運動和增殖等方面發(fā)揮重要作用。本研究結果表明，IQGAP1在HCC組織中呈高表達，且與腫瘤的分級、轉移和VM的形成相關。將過表達質粒轉入HepG2細胞后，遷移侵襲增殖能力明顯增強，而將干擾質粒轉入SMMC7721后，遷移侵襲增殖能力明顯減弱。IQGAP1可以通過多種途徑影響遷移侵襲，如激活Rac1/Cdc42信號通路，促使細胞形成侵襲性偽足，與肌動蛋白形成多聚體，引導細胞定向運動，促進腫瘤轉移［15］。IQGAP1的增高還可以減少正常細胞連接的E-cadherin復合體形成，降低細胞間的黏附力，加速腫瘤細胞的脫落、轉移［16］。同時，IQGAP1的過表達還可以加速細胞外基質的降解，從而增強腫瘤細胞的侵襲能力［17］。IQGAP1具有促進細胞增殖的能力，在MAPK/Raf/MEK/ERK信號傳導通路、Wnt通路中均發(fā)揮重要作用［18］。

CD133、CD44是已經明確的HCC標志物［19］。CD133是一種跨膜糖蛋白、經典的腫瘤干細胞標記物，CD133參與腫瘤的生成，提高化學耐藥性及出現原始異型性腫瘤的能力。CD44是一種細胞表面黏附分子，廣泛分布于細胞膜表面，與透明質酸反應后能促進毛細血管增生，促進腫瘤的發(fā)展與轉移。Sox家族最初發(fā)現于胚胎干細胞，是維持胚胎干細胞生長，控制胚胎發(fā)育的重要轉錄因子。相關研究表明，Sox2的增多與HCC細胞密切關聯(lián)［20］。ALDH1屬于乙醛脫氫酶的基因家族編碼的蛋白質之一，具有乙醛脫氫酶的生物學特性，可在醫(yī)學中作為腫瘤干細胞標志物。大量研究表明，ALDH1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［21］。

IQGAP1是IQGAP蛋白家族中研究較為深入且功能廣泛的成員。本研究表明，IQGAP1在HCC組織中高表達，與患者的臨床分期、轉移、不良預后及VM的形成相關。細胞實驗顯示，隨著IQGAP1表達的增高，細胞的遷移、侵襲、增殖、成管能力也增強，CD133、CD44、Sox2和ALDH1表達同時增加。本研究從人體組織和體外細胞兩方面探討了IQGAP1在HCC的VM形成中的作用，證明了IQGAP1與VM的形成密切相關，IQGAP1的升高促進了HCC細胞的惡性生物學行為，增強了HCC細胞的干性，推測IQGAP1可能是通過誘導HCC細胞的干性來促進VM的形成。本研究豐富了IQGAP1在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為HCC VM的發(fā)展機制提供了新的視角。隨著IQGAP1的研究深入，亟需出現以IQGAP1為靶向的抗腫瘤藥物應用于HCC及其他腫瘤的預防。

[1] Li Q.Liver cancer:challenge and prospect[J].Cancer Biol Med,2016,13(4):405-406.

[2] Zhang XF,Yang X,Jia HL,et al.Bcl-2 expression is a poor predictor for hepatocellular carcinoma prognosis of andropause-age patients[J].Cancer Biol Med,2016,13(4):459-468.

[3] Lauerer M,Kaiser K,Nagel E.Organ transplantation in the face of donor shortage-ethical implications with a focus on liver allocation[J].Visc Med,2016,32(4):278-285.

[4] Sun J,Sun B,Sun R,et al.HMGA2 promotes vasculogenic mimicry and tumor aggressiveness by upregulating Twist1 in gastric carcinoma[J].Sci Rep,2017,7(1):2229.

[5]LiuT,SunB,ZhaoX,et al.USP44+cancer stemcell subclones contribute to breast cancer aggressiveness by promoting vasculogenic mimicry[J].Mol Cancer Ther,2015,14(9):2121-2131.

[6] Sanchez-Laorden B,Viros A,Marais R.Mind the IQGAP[J].Cancer Cell,2013,23(6):715-717.

[7] Li L,Tian T,Zhang X.Mutation mechanisms of human breast cancer[J].J Comput Biol,2018,25(4):396-404.

[8] Tanos BE,Yeaman C,Rodriguez-Boulan E.An emerging role for IQGAP1 in tight junction control[J].Small GTPases,2016:1-9.

[9] Sun G,Liu Y,Wang K,et al.miR-506 regulates breast cancer cell metastasis by targeting IQGAP1[J].Int J Oncol,2015,47(5):1963-1970.

[10]Jin X,Liu Y,Liu J,et al.The overexpression of IQGAP1 and beta-catenin is associated with tumor progression in hepatocellular carcinoma In vitro and in vivo[J].PLoS One,2015,10(8):e0133770.

[11]Liu Y,Liang W,Yang Y,et al.IQGAP1 regulates actin cytoskeleton organization in podocytes through interaction with nephrin[J].Cell Signal,2015,27(4):867-877.

[12]Johnson MA,Henderson BR.The scaffolding protein IQGAP1 co-localizes with actin at the cytoplasmic face of the nuclear envelope:implications for cytoskeletal regulation[J].Bioarchite,2012,2(4):138-142.

[13]王啟釗,呂穎慧,費凌娜,等.腫瘤基因治療的研究進展與思考[J].中國腫瘤臨床,2010,37(15):893-896.

[14]湯井嬌,蔣曉東.抗血管生成藥物長期治療致腫瘤侵襲轉移相關機制的研究進展[J].中國腫瘤臨床,2016,43(7):310-313.

[15]Choi S,Thapa N,Hedman AC,et al.IQGAP1 is a novel phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate effector in regulation of directional cell migration[J].EMBO J,2013,32(19):2617-2630.

[16]Wu Y,Chen YC.Structure and function of IQ-domain GTPase-activating protein 1 and its association with tumor progression(Review)[J].Biomed Rep,2014,2(1):3-6.

[17]王夏煒,曹永倩,張芮.支架蛋白IQGAP1與腫瘤研究現狀[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(20):1657-1661.

[18]Jacquemet G,Morgan MR,Byron A,et al.Rac1 is deactivated at integrin activation sites through an IQGAP1-filamin-A-RacGAP1 pathway[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 18):4121-4135.

[19]Rozeik MS,Hammam OA,Ali AI,et al.Evaluation of CD44 and CD133 as markers of liver cancer stem cells in egyptian patients with HCV-induced chronic liver diseases versus hepatocellular carcinoma[J].Electron Physician,2017,9(7):4708-4717.

[20]Sun C,Sun L,Li Y,et al.Sox2 expression predicts poor survival of hepatocellular carcinoma patients and it promotes liver cancer cell invasion by activating slug[J].Med Oncol,2013,30(2):503.

[21]Yang CK,Wang XK,Liao XW,et al.Aldehyde dehydrogenase 1(ALDH1)isoform expression and potential clinical implications in hepatocellular carcinoma[J].PLoS One,2017,12(8):e0182208.