高氧對宮內缺氧新生大鼠海馬齒狀回血管內皮生長因子表達的影響

蔣麗雯，劉 銚，何 丹，郝 雯，李軍成，余 鴻

（西南醫科大學：1臨床醫學院2013級本科；2組胚教研室，四川瀘州 646000）

宮內缺氧在胚胎發育期很常見，是影響胚胎發育的重要因素,通常會引起新生兒缺氧缺血性腦病，可能導致急性腦損傷、隨后的認知缺陷和兒童癲癇的發生。神經細胞對缺氧較為敏感，尤其是海馬區神經元對缺氧極為敏感。因此，研究缺氧對海馬神經元的影響具有重要意義。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進血管再生，故在神經系統損傷修復過程中VEGF具有十分重要的作用。宮內缺氧在臨床治療上還未有特異性藥物，而高氧治療不乏為較好的一般治療措施，但其治療機制還未闡明。為此，本實驗通過建立宮內缺氧模型，檢測宮內缺氧后新生大鼠海馬區VEGF表達的變化，并觀察高氧治療后的VEGF表達變化，從而探討高氧對宮內缺氧的治療作用機制，為臨床宮內缺氧的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

體重230～260 g的15只成年雌性SD大鼠和3只成年雄性SD大鼠由西南醫科大學動物中心提供（一級實驗動物，許可證號：川實動管質第17號）。

1.1.2 主要試劑及儀器

小鼠抗VEGF一抗、生物素化羊抗鼠二抗（SABC）試劑盒，多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）、DAB顯色試劑盒（棕黃色）均購自武漢博士德生物工程有限公司。德國Leica RM2245電動切片機，美國REV?CO公司的三氣培養箱，日本Olympus公司的Ax-70熒光顯微成像系統，Media Cybernetics公司的Im?age-Pro Plus6.0圖像分析系統。

1.2 方法

1.2.1 動物配種、飼養、分組

健康成年雌性SD大鼠15只，每只先后分別與一只雄鼠合籠飼養配種，第二日早晨發現雌鼠陰栓記為雌鼠妊娠0 d，取出雌鼠，單獨飼養至孕期15 d。將15只孕鼠隨機分為：對照組（CG組）、缺氧組（HG組）和高氧組（HOG組），每組5只。

1.2.2 動物造摸

自孕15 d開始將缺氧組和高氧組孕鼠置于三氣培養箱中（事先設置氧濃度130 mL/L，二氧化碳濃度0.3～0.4 mL/L，相對濕度 75% ～80%，溫度250C），缺氧2 h/d，連續缺氧5 d（孕15～19 d）。高氧組孕鼠每次缺氧后在正常環境生活1 h后再次放入三氣培養箱中（設置氧濃度500 mL/L，二氧化碳濃度0.3～0.4 mL/L，相對濕度75%～80%，溫度250C）。對照組不缺氧也不用高氧治療。3組孕鼠待其自然分娩（第21 d），每只孕鼠可產新生鼠5～8只。

1.2.3 取材、石蠟切片、免疫組化

每窩新生鼠隨機選取4只，取其大腦組織（每組均可得20個大腦組織），分別放入40 g/L的多聚甲醛中固定60 min。常規石蠟包埋、經海馬冠狀切面切片（片厚4 μm），各切片作VEGF（一抗濃度1∶400）免疫組化染色（SABC法），DAB顯色。

1.2.4 照相、圖像分析

應用Olympus Ax-70熒光顯微成像系統對各免疫組化染色切片照相，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對每張VEGF免疫組化200倍照片均在海馬齒狀回相同視野選取相同大小的區域進行圖像分析，統計每張切片的陽性細胞的IOD值。

1.3 數據分析

用SPSS 16.0統計軟件包進行統計分析，計量資料用±s（均數±標準差）表示，3組間的比較采用單因素方差分析，每兩組間的比較用LSD檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

對照組VEGF陽性細胞胞質染為棕黃色，細胞大而圓，在齒狀回主要分布于錐體細胞層，該層細胞主要是神經細胞，分布較集中；與對照組相比，缺氧組VEGF陽性細胞的分布無變化，但陽性細胞數量較對照組增多、染色增強，其積分光密度值增大（P＜0.05）。高氧組VEGF陽性細胞分布也與對照組相似，與缺氧組相比，數量變化不明顯，但染色明顯增強，其積分光密度值均增大（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 3組VEGF陽性細胞IOD值±s)

表1 3組VEGF陽性細胞IOD值±s)

注：a與CG組比較，P＜0.05；b與HG組比較，P＜0.05。

組別CG組HG組HOG組n 20 20 20 FP VEGF 48.37±5.29 73.65±5.94a 90.47±7.53ab 224.592 0.000

3 討 論

VEGF作為一種調節性蛋白，廣泛存在于機體多種組織、器官內，具有神經營養和神經保護作用。在應激狀態下，可通過促進血管內皮細胞增殖、增強血腦屏障對葡萄糖的通透性以及抗氧化等作用抑制神經細胞凋亡、促進神經再生。楊瑤瑤等[1]通過采用CoC12構建Hela細胞體外缺氧微環境模型，應用實時熒光定量PCR法和免疫細胞化學技術發現人宮頸癌Hela細胞的VEGF-mRNA和VEGF蛋白的表達隨著缺氧時間（3～24 h）的增加而逐漸增加。Troll?mann等[2]研究表明，缺氧可刺激大腦皮層、海馬及胎盤缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）的表達增高。萬紹勇等[3]研究發現新生兒發生窒息所致新生兒大腦缺氧、缺血后，腦組織中VEGF水平明顯升高，且因新生兒血腦屏障發育還不完善,故VEGF能夠較早地釋放入血。也有研究表明，在新生大鼠急性缺血缺氧后，大鼠大腦側腦室會出現短時間內上調的 VEGF 表達[4]。最近，SatriotomoI等[5]研究發現，急性間歇性缺氧可增強脊髓非呼吸運動神經元VEGF的免疫活性，并提示急性間歇性缺氧可能成為治療脊髓損傷和運動神經元疾病等的治療手段；Rodriguez-Alvarez等[6]也發現，新生7 d的大鼠全腦缺氧（5%的氧氣）15 min，可致大鼠海馬體VEGF的表達增加。說明缺氧可刺激神經組織內VEGF的表達，而VEGF的高表達，又是神經組織內血管內皮存活和增生的中心環節，從而促使神經元及神經膠質細胞再生，因此，VEGF的高表達是整個大腦缺氧缺血損傷后修復的關鍵。不僅如此，Plaschke等[7]還證實了VEGF的高表達在大鼠空間學習和記憶等認知功能上有保護作用。在本實驗中，胞質染為棕黃色的VEGF陽性細胞大而圓，主要分布于齒狀回錐體細胞層，而該層細胞主要為神經細胞；有宮內缺氧的新生大鼠海馬齒狀回VEGF表達較對照組新生大鼠明顯增高，說明缺氧刺激所致的VEGF高表達可能是機體抵抗缺氧的一種自我保護機制，通過VEGF的高表達而刺激局部組織的血管增生、使局部神經組織的血-腦屏障對血液中葡萄糖的通透性增高，從而抑制神經細胞凋亡，而達到自我保護的狀態。

圖1 3組新生大鼠海馬齒狀回VEGF表達變化（SABC法，×200）

王濤[8]的研究表明，高壓氧干預能夠實現脊髓損傷大鼠脊髓組織內VEGF的高表達，延長VEGF高表達的時間，從而發揮神經保護作用。本實驗中應用高氧治療后，新生大鼠海馬齒狀回VEGF表達又較缺氧組有進一步的增高，說明缺氧所致的VEGF表達增加尚不足以抵抗由于持續5 d(2 h/d)的宮內缺氧（130 mL/L）所導致的神經損傷作用，而通過高氧治療使VEGF的表達進一步增高，從而增強了神經保護及修復作用，進一步刺激損傷區的血管發生以改善局部的缺血、缺氧環境，最終達到一種治療的效果。

4 結 論

宮內缺氧可促進新生大鼠海馬齒狀回區VEGF的表達，高氧治療可進一步增強該區神經組織VEGF的表達。

1. 楊瑤瑤，陳麗，龔莉，等.缺氧微環境對宮頸癌Hela細胞HIF-1α及VEGF-A表達的影響[J].西南醫科大學學報，2017，40（2）：123-127.

2. Trollmann R，Strasser K，Keller S，et al.Placental HIFs as markers of cerebral hypoxic distress in fetal mice[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，295(6)：1 973-1 981.

3. 萬紹勇，明靖淞，藍照，等.關于新生兒缺氧缺血性腦病患兒VEGF、CK及CK-BB檢測的臨床價值[J].中國民康醫學，2016，28（12）：46-47.

4. Bain J M，Moore L，Ren Z，et al．Vascular endothelial growth factors-A and C are induced in the SVZ follow?ing neonatal hypoxia—ischemia and exert diferent effects on neonatal glial progenitors[J]．Transl Stroke Res，2013，4(2)：158-170．

5. SatriotomoI，Nichols NL，Dale EA.et al.Repetitive acute intermittent hypoxia increases growth/neurotrophic factor expression in non-respiratory motor neurons[J].Neuroscience，2016，322：479-488.

6. Rodriguez-Alvarez N，Jimenez-Mateos EM，Dunleavy M.et al.Effects of hypoxia-induced neonatal seizures on acute hippocampal injury and later-life seizure susceptibil?ity and anxiety-related behavior in mice[J].Neurobiol Dis，2015，83：100-114.

7. Plaschke K，Staub J，Ernst E，et al.VEGF overexpression improves mice cognitive abilities after unilateral common carotid artery occlusion[J].Exp Neurol，2008，214(2)：285-292.

8. 王濤.高壓氧干預對大鼠脊髓繼發性損傷中HIF—lα及VEGF表達的影響[J].現代中西醫結合雜志，2015，24（22）：2 403-2 405.