高脂飲食對雌性大鼠性發育中樞相關基因GnRH mRNA及GnRH-RmRNA表達水平的影響

董逸翔，陳華，矯金玲，陶敏

性發育特征初顯年齡較正常兒童平均年齡提前2個標準差以上[1]，或男童在9歲、女童在8歲前出現第二性征者[2]稱為性早熟。在臨床上根據其發病機制和病因又分為中樞性與外周性兩大類。

現今已證實兒童性成熟年齡的提前主要是外界因素作用的結果，其中營養飲食結構的改變尤為重要[3]。筆者團隊前期研究發現高脂肪飼料喂養的幼齡雌性SD大鼠，其陰道開口及第一次發情間期均提早出現，其子宮、卵巢指數增高，血清促黃體生成素（LH）水平上升，表明高脂飲食可促使大鼠青春期啟動提前[4]。本實驗將繼上述研究，以下丘腦GnRH mRNA與垂體GnRH-R mRNA為觀察指標[5]，從基因層面探討高脂飲食對性發育中樞下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的影響。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物分組 出生21d清潔級斷乳SD雌性大鼠10窩，購自上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，合格證號為2008001601321，平均體質量為（45±5）g，飼養在浙江中醫藥大學動物實驗中心。按配對設計原則，依據窩別與體質量選取20只大鼠，分為高脂組與標準組，各組10只，分別喂飼高脂肪飼料及標準飼料，并于溫度18～23℃，濕度60%～80%，每天14 h光照的環境下自由攝食、飲水。

1.2 動物飼料 標準飼料、高脂飼料由南通特洛非飼料科技有限公司提供，高脂飼料的脂肪供能比在標準飼料的基礎上上調至45%[6]。各組飼料具體成分見表1。

1.3 實驗方法 高脂組予高脂肪飼料，標準組予標準飼料，自由攝食、飲水，從實驗第1天（大鼠21日齡）至大鼠處死日（大鼠36日齡），每天9：00觀察大鼠陰道口開放情況。對陰道口開放的大鼠，每天進行陰道細胞涂片觀察其性周期的變化。待高脂組大鼠均出現陰道口開放時，即實驗第16天、大鼠36日齡時，于當天15：00在水合氯醛麻醉下處死所有大鼠，獲取下丘腦及垂體，置于－80℃冰箱凍存備用。組織總RNA提取、cDNA第一鏈合成、PCR反應及檢測等操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，最后以Realtime-PCR技術，將 -actin作為內參，相對表達量“2－△△Ct”值來表示目的基因下丘腦GnRHmRNA和垂體GnRH-RmRNA的相對表達水平。

1.4 試劑及引物 RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑均購自北京天根生化科技有限公司，批號分別為 L1029、L0924、L1008；PCR引物根據Gene Bank提供序列由上海生工生物工程公司合成，其核苷酸序列如下：-actin正向5’-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3’，反向 5’-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’，產物 155bp；下丘腦GnRHmRNA正向5’-TGGTATCCCTTTGGC TTT-3’，反向 5’-CTCCTC CTT GCC CAT CTC-3’，產物188bp；垂體GnRH-RmRNA正向5’-GACGGT GAC TTT CTT CCT TTT C-3’，反向 5’-CTC TCC AGCATA CCA CTGAACA-3’，產物 169 bp。

1.5 統計方法 實驗數據采用SPSS17.0統計軟件包分析統計。由于相對表達量“2－△△Ct”為非正態分布的數據，統計時先轉換成正態分布數據，數據以均數±標準差表示，采用 檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下丘腦GnRH mRNA相對表達量比較 高脂組大鼠下丘腦GnRHmRNA相對表達水平高于標準組（=2.307＜ 0.05），見表 2。

2.2 垂體GnRH-R mRNA相對表達量比較 高脂組大鼠垂體GnRH-RmRNA相對表達水平高于標準組（=4.359＜ 0.01），見表 3。

表1 各組飼料成分及各成分含量 g

表2 兩組間下丘腦GnRH mRNA相對表達量比較

表3 兩組間垂體GnRH-RmRNA相對表達量比較

3 討論

自20世紀60年代以來，隨世界經濟發展、營養狀況改善，出現了兒童體格以及青春發育年齡提前的世界性趨勢，迄今為止已明確青春期發育會受到基因、營養健康狀況、環境及社會經濟等因素的影響。瑞典一項調查顯示[7]：將生活條件相對落后國家的女孩移民至比利時之后，有1/3出現了性發育提前；之后研究證實這一部分女孩在移民之前以低蛋白、低熱量的素食為主，移民后飲食結構向高熱、高脂、高蛋白飲食轉變。我國也有相關調查表明，已確診為性早熟的患兒其日常飲食中攝取的動物類食物較正常同齡兒童多[8]，這些都提示了青春期發育提前與飲食結構以及肥胖率之間存在一定的關聯性。

在人類正常青春期發育與中樞性性早熟發病過程中，HPGA功能的激活至關重要。性發育啟動前，HPGA處于相對靜止狀態[9]；性發育開始啟動時，GnRH分泌增加，激活垂體分泌促黃體生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH），從而促進性腺分泌，可見青春期的啟動一定程度上源于HPGA的準確發動。對于人類，上述過程啟動的年齡跨度很大，其調控因素復雜，但可以肯定的是很多情況下是發生在基因水平上的[10]。有國外研究顯示，人群中性成熟的年齡接近于正態分布，提示了性早熟性狀的差異并非只緣于單一位點的突變，而是由多基因共同決定的[11]。

作為研究性發育的首選實驗動物，SD大鼠的HPGA功能與人類相似，其性周期明顯短于人類，性發育特征表現明顯，便于實驗觀察。大鼠青春期啟動、HPGA激活，此時與性發育相關的一系列基因表達水平出現相應的生物學改變[12]，譬如下丘腦GnRH mRNA表達水平開始提升，并指導合成GnRH；垂體GnRH-R mRNA表達水平相應提升，指導合成GnRH-R，兩者為配受體關系。當GnRH脈沖式分泌水平上調、脈沖幅度增大、出現晝夜節律性變化時，接受GnRH刺激的垂體細胞膜表面GnRH-R也相應增加，GnRH與GnRH-R結合所釋放的一系列生物信號促使垂體前葉分泌LH、FSH，進而影響性腺分泌相關性激素，HPGA功能從而完全啟動。

本實驗說明，相比于正常標準飲食，高脂飲食更容易引發大鼠HPGA提前啟動，進而導致性發育提前；從基因層面上看，高脂飲食對于HPGA的影響可以通過促進大鼠下丘腦GnRH mRNA、垂體GnRHR mRNA這些性發育相關基因的表達實現，這都提示了合理飲食、避免攝入過多脂肪應作為預防性早熟的重要措施。至于高脂飲食是否可影響其他性發育相關基因的表達，其作用又是通過哪些途徑發生；基于人類日常飲食結構，不可能只進食高脂飲食，故而高脂、高蛋白混合飲食是否可致HPGA提前啟動，混合飲食相對于單純高脂飲食是否更易引發性早熟等問題仍需進一步研究。

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