B303亞型的血型分子機制及臨床輸血分析

華琳，賀云蕾，俞露，郭雯玉，許德義，鄧剛

ABO血型系統中，除了A、B、O、AB 4種常見表型外，在人群中還存在一些少見的ABO亞型。實際工作中時常會遇到正反定型不相符的現象，其中較大一部分則是由于亞型的原因引起，正確鑒定紅細胞血型是確保臨床安全用血的關鍵[1]。本文對1例B303亞型患者的臨床輸血情況進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 1例女性患者因外傷做手術，術前配血時發現ABO血型正反定型不符合，故醫院將患者血液標本送到本實驗室。

1.2 血型血清學檢測 血清學正反定型及吸收放散試驗均按常規方法操作。主要試劑有：單克隆抗-A、抗-B及反定型紅細胞（上海血液生物醫藥有限責任公司），人源抗-A、抗-B抗體（自制），抗-AB、抗-H抗體（荷蘭sanquin公司）。

1.3 序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCR-SSP）進行ABO血型基因分型采用RelaxGene Blood DNA System（北京TIANGEN公司）提取樣本DNA，具體操作按試劑說明進行。采用ABO血型基因分型試劑盒Ready Gene ABO（德國inno-train公司）進行PCR-SSP分型。

1.4 ABO基因測序分析 按照參考文獻[2-3]中的引物及擴增體系，對ABO基因7個外顯子及其鄰近內含子區分別擴增后送測序公司（上海桑尼測序有限公司）測序。Taq酶購自上海Promega公司，PCR儀為Veriti96Well Thermal Cycler（美國，AB公司），反應總體積50 l。1.5 PCR產物克隆測序 將3、6、7外顯子的PCR產物純化并克隆入pMD8-T載體（TaKaRa公司）后，送公司測序（上海桑尼測序有限公司）。

2 結果

2.1 血清學檢查結果 根據血清學結果，初步判斷患者為B亞型。見表1。

2.2 PCR-SSP檢測結果 根據試劑盒說明書，內參產物片段大小為434 bp，各泳道的特異性陽性條帶DNA分子量大小分別為 1（134 bp）、2（133 bp）、3（194 bp）、4（193 bp）、5（195 bp）、6（194 bp）、7（170 bp）、8（170 bp）。先證者電泳圖中第3和7泳道未出現陽性條帶，對照試劑盒說明書可判定基因型為O/B型（封三彩圖 7）。

2.3 ABO基因測序分析 患者ABO基因的第1～5外顯子未發現任何突變，但第6外顯子的261位為G缺失，297位A＞G純合突變。第7外顯子上存在：526G/C、657T/C、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、646T/A、681G/A、771T/C、829A/G雜合。分析鄰近外顯子的內含子區域，發現第 3內含子存在IVS+5G＞A雜合突變（封三彩圖8）。2.4 單體型序列分析 對患者標本進行TA克隆后測序發現，一條單體型為常見的O20，而另一條單體型與B101相比，存在IVS3+5G＞A雜合突變，此突變可引起異常剪切，影響D-半乳糖轉移酶（GTB）正常表達。經檢索血型抗原基因突變數據庫BGMUT，患者基因型為B303/O20。見封三彩圖8。

3 討論

ABO血型系統具有重要的臨床意義，可引起溶血性輸血反應和新生兒溶血病。ABO基因的直接編碼產物是2個糖基轉移酶，N-乙酰氨基半乳糖轉移酶（GTA）和GTB。通過這2個酶的催化作用，在紅細胞膜的H前體糖鏈上分別添加2個不同的單糖基團，并分別形成A或B抗原，可見轉移酶是抗原形成的關鍵[4]。B3亞型是ABO血型一種較為常見的弱表現型，其血清學最主要特點是B3細胞與相應抗體出現混合視野外觀。已證實 ABO血型系統不同的亞型是由于基因水平上核苷酸變化所引起的，其突變范圍涉及7個外顯子和部分內含子區域，包括缺失、插入和點突變[5-6]。

表1 先證者及家系血清學檢查結果

本例患者血清學特點是正定抗-B出現混合凝集，反定存在冷反應性抗-B抗體，符合B3亞型的特征。測序結果表明，與B101序列相比，患者有一條等位基因第1～7外顯子與正常GTB基因一致，僅在第3內含子發生IVS3+5G＞A雜合突變，此突變可影響剪接供體，使其發生異常剪切，RNA加工時第3外顯子被直接跳過，導致該基因的轉錄本中沒有第3外顯子，翻譯產物中缺乏19個氨基酸，影響GTB正常表達，可能導致GTB酶的活性或特異性改變，導致B抗原數量或特異性的改變，屬于比較少見的B303亞型。Yu等[7]最早對B303亞型進行了報道。目前發現的B3等位基因己有 16種[8]，其中12例（B301、B302、B304、B305、B306、B307、B308、B309、B310、B313、B315、B316）為外顯子上的點突變導致不同的氨基酸改變，1例（B314）為第1外顯子上堿基缺失導致移碼突變，2例（B311、B312）為起始密碼子上游調控區域堿基缺失或突變。而B303等位基因則與上述3個B3等位基因有發生機制所不同，是由于內含子突變導致的剪切異常而形成。

ABO亞型的血液，由于抗原與抗體共存，在臨床使用過程中往往表現為血型定型和配血困難。由于各種原因，B亞型往往被誤定為O型，誤定為O型的B亞型患者，若輸注了O型血液；或誤定為O型的B亞型獻血者的血液，輸注給O型患者，常常會出現輸血反應。本例患者由于是B亞型，臨床輸血時使用洗滌O型紅細胞及AB型血漿，輸注O型洗滌紅細胞雖然相對安全，但畢竟為異型血，仍要控制輸血速度，并控制單次輸血量和輸血間隔時間，同時也要嚴格做好圍術期的血液管理，減少自體血液的丟失和異體血的輸入。綜合上述措施，本例患者取得了不錯輸血效果。

參考文獻：

[1] Hult AK,Yazer MH,Jorgensen R,et al.Weak a phenotyes associated with novel ABOallelescarryingthe A2-related 1061C deletion and various missense substitutions[J].Transfusion,2010,50(7)：1471-1486.

[2] Zhu F,Tao S,Xu X,et al.Distribution of ABOblood group alleleand identification of three novel alleles in the Chinese Han population[J].Vox Sang,2010,98(4)：554-559.

[3] 洪小英,應燕玲,許先國,等.一例ABO亞型ABx09的分子生物學研究和鑒定[J].中華醫學遺傳學雜志,2011,28(5)：548-551.

[4] Freyburger G,Trillaud H,Labrouche S,et al.D-dimer strategy inthrombosisexclusiona gold standard study in 100 patients suspected of deep venous thrombosis or pulmonary embolism：8 DD methods compared[J].Thrombosis&Haemostasis,1998,79(1)：32-37.

[5] Blumenfeld OO,Patnaik SK.Allelic genes of blood group antigens：a source of human mutations and cSUPs documented in the Blood Group Antigen Gene Mutation Database[J].Human Mutation,2004,23(1)：8-16.

[6] Daniels G.Human blood groups[M].2nd ed.Oxford：Black well science,2002：17-59.

[7]Yu LC,Twu YC,Chou ML,etal.Molecular genetic analysis for the B(3)allele[J].Blood,2002,100(4)：1490-1492.

[8]Patnaik SK,Helmberg W,Blumenfeld OO.BGMUT database of allelic variants of genesencodinghumanblood group antigens[J].Transfus Med Hemother,2014,41(5)：346-351.