HLA配型在免疫性血小板輸注無效患者中的應用研究

施蔚，杜容

血小板是血液的一種重要的組成部分，具有改善血液系統疾病及相關疾病患者出血癥狀，及降低出血致死率的重要功效[1-2]。然而血小板輸注治療也并非是無任何局限性的，其臨床療效也無法滿足患者的全部意愿。血小板輸注無效（PTR）是臨床輸血治療當中經常遇到的一項嚴重問題，也是血小板維持治療患者的一項最為嚴重難題，臨床上PTR的發生率較高，因此受到臨床廣泛關注。由血小板同種人類白細胞抗原（HLA）抗體導致的免疫性PTR為PTR的一種最常見類型。免疫性 PTR的最佳解決方法為根據患者的HLA抗體檢測結果輸注與患者HLA能夠相容的血小板，因此HLA抗體的檢測方法對于血小板臨床輸注治療具有關鍵性作用[3-4]。本研究比較傳統補體依賴微量淋巴細胞毒交叉法與流式細胞血小板交叉法對檢測 HLA抗體的價值，并對根據檢測結果配型后的血小板輸注治療效果與患者臨床癥狀及血小板計數的相關性與差異性進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省諸暨市人民醫院2014年1月至2017年1月收治的不同疾病血小板輸注超過2次的患者78例，排除非免疫性PTR患者。其中男42例，女36例；年齡18～61歲，平均（41.26±10.06）歲。

1.2 檢測方法 全部患者分別采取流式細胞血小板交叉法（Flow-XM）及補體依賴微量淋巴細胞毒交叉法（NIHCDC）檢測HLA抗體。使用恒信化學試劑公司出品的淋巴細胞分離試劑；美國Becton Dickinson出品的PE抗人CD3單體克隆抗體、FITC抗人IgG單體克隆抗體。檢測設備為美國BD公司出品的FACSCanto-Ⅱ型流式細胞儀，上海精誼儀器設備公司出品的XSY-1倒置熒光顯微鏡。以Ficoll-Hypaque離心梯度法分離出供應血源的淋巴細胞，按1×PBS對淋巴細胞的數量進行調整后開展后續檢測。分離后的淋巴細胞分別行 NIHCDC、Flow-XM檢測。以同期在本院接受健康體檢的AB型血健康者混合血清設制為陰性對照血清。

NIH-CDC檢測，將淋巴細胞的懸合液與對照血清及補體于37℃下共同孵育60min，使用熒光液終止并固定反應，使用熒光倒置顯微鏡觀察結果。

Flow-XM檢測，將分離出的淋巴細胞懸合液與預處理的血清充分混勻，于室溫條件下孵育15 min，選取適當滴度熒光抗體FITC-抗IgG、PE-抗CD3標記染色、孵育后使用流式細胞儀進行檢測。比例為1×105～1.25×105細胞，預處理的受者血清劑量為25 l，讀取10000個淋巴細胞。兩種檢測方法的陽性結果均以陰性對照血清的均值作為判斷標準。

1.3 觀察指標 比較NIH-CDC、Flow-XM檢測HLA的陽性率；將患者最后一次以隨機輸注ABO同型血小板后的臨床效果與NIH-CDC、Flow-XM配型后（取最高陽性結果）輸注的效果進比較；同時觀察患者治療前后血小板計數及臨床出血癥狀的變化情況；分析不同配型輸注血小板的效果與血小板計數及出血癥狀的相關性。

1.4 統計方法 采用SPSS20.0統計軟件進行處理，計量資料以均數±標準差表示，比較采取 檢驗；計數資料比較采用2檢驗；相關性分析采取Spearman等級相關性分析＜0.05為差異有統計學意義。

表1 Flow-XM配型輸注前后血小板計數及出血癥狀發生率比較

2 結果

2.1 HLA抗體陽性率 Flow-XM檢測HLA抗體的陽性 73例，準確率為93.59%；NIH-CDC檢測陽性65例，準確率為 83.33%。兩者準確率差異有統計學意義（2=4.019＜ 0.05）。

2.2 臨床效果 Flow-XM 配型后臨床有效72例，有效率為92.31%；隨機輸注臨床有效2例，有效率為2.56%。Flow-XM配型臨床有效率高于隨機輸注臨床有效率（2=125.972＜ 0.05）。

2.3 血小板計數及臨床癥狀觀察 輸注后血小板計數顯著升高，出血癥狀發生率顯著下降，差異均有統計學意義（＜0.05）。見表1。

2.4 相關性分析 Flow-XM 配型輸注的臨床有效率與出血癥狀發生率呈中度正相關（=0.577＜0.05），與血小板計數呈高度負相關（=－0.896＜0.05）。

3 討論

隨著我國經濟水平的不斷提高，汽車保有量極大增長，建筑生產類項目大量開展，交通傷、墜落傷等外傷發生率的不斷升高，同時隨著氣候、環境、生活習慣等的重大改變，我國出血性疾病的發生率也逐年上升，這就對臨床輸血治療提出了更高、更全面的要求。PTR的發生可對患者的臨床救治、身體健康與生命安全均構成嚴重威脅。導致 PTR發生的主要因素有免疫性因素與非免疫性因素[5-8]。非免疫性因素包括血小板質量、彌散型血管內凝血、骨髓移植、發熱感染、循環型免疫復合物、脾腫大、自身抗體以及藥物相關抗體等。免疫因素包括，HLA抗體、血小板特異性（HPA）抗體、紅細胞的相關抗體[9-10]。免疫因素中以HLA抗體最為常見臨床發生率約為80%，其次為HPA抗體臨床發生率為5%～10%。血小板的細胞膜上存在有HLAA與HLA-B兩個位點抗原，另外血小板的特異性糖蛋白的陽性表達于 PTR的發生也具有不容忽視的作用，其中以抗GPIIb/IIIa的自身型抗體為主。

近些年來，流式細胞儀的技術水平與其分析軟件均不斷完善，單體克隆抗體被廣泛研發，改進Flow-XM的檢測方法，研發既能夠定性也能夠定量，既能夠實現基因分型也能夠實現抗體分析的一項流式細胞檢測方法對于 PTR的防治具有重要價值。血小板資源是臨床上一種十分寶貴的醫療資源，Flow-XM檢測一方面能夠提高PTR的治療效果，另一方面能夠有效地節約血小板資源，對于血液、血小板輸注治療均具有不可或缺的價值。

本研究表明，Flow-XM法檢測的準確率優于傳統的NIH-CDC檢測法（＜0.05）。在 Flow-XM 與 NIH-CDC檢測結果均呈陰性的樣本當中未檢測出存在針對供應血源的HLA抗體。Flow-XM與NIH-CDC檢測結果均呈陽性的標本，通過對供、受雙方HLA分型驗證，均存在有針對供方的HLA抗體。Flow-XM陽性但 NIH-CDC呈陰性的血樣，在PRA陽性患者的樣本中檢測存在有針對供方HLA抗原的明確特異性抗體。同時本研究還發現，Flow-XM配型輸注的臨床有效率與出血癥狀發生率呈中度正相關（=0.577＜0.05），與血小板計數呈高度負相關（=－0.896＜0.05）。

綜上所述，HLA配型在免疫性PTR中的應用具有重要價值，能夠有效提高輸注療效，改善出血癥狀。

參考文獻：

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