大黃素甲醚對白血病耐藥細胞系K562/ADM耐藥性的影響及機制研究*

楊璇，高菲，劉文君

（西南醫科大學附屬醫院 兒科，四川 瀘州 646000）

慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是造血干細胞的惡性轉化，其發病率為1～2/100 000[1]。隨著CML病程的進展其化療耐藥性也隨之增加，化療失敗是CML高死亡率的關鍵因素。因此，發現能提高治療效果的新方法并且克服藥物的耐藥性具有重要意義。微小RNA（MicroRNAs，miRNA）是大小為18～25個核苷酸，進化高度保守的內生非編碼小RNAs。其在腫瘤中異常表達，并且能作為癌基因通過結合目標mRNA的3'-UTR抑制mRNA的翻譯或裂解目標mRNAs誘導其退化[2]。除了實體腫瘤，miRNA也在許多不同的血液惡性腫瘤中異常表達，如慢性淋巴白血病、急性髓系白血病、骨髓增殖性腫瘤。對CML，ROKAH等[3]發現與對照組細胞相比，下調K562細胞中的miRNA-31、miRNA-34a、miRNA-155及miRNA-564后，miRNA在CML發病機制中具有潛在的作用，miRNAs可能是CML治療的新靶點[4]。大黃的藥用成分是大黃素甲醚，曾被用作瀉藥，有護肝、抗炎及抗菌的特性。研究發現大黃素甲醚能夠干預癌細胞的生理活動，其中包括細胞凋亡[5-6]，細胞生長周期[7]及轉移[8]。然而，大黃素甲醚在血液惡性腫瘤中的作用尚未闡明。本研究將探討miRNA-146a對CML細胞（K562/ADM）耐藥性的影響以及大黃素甲醚對K562/ADM多藥耐藥性的逆轉效應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人CML細胞系K562細胞和耐阿霉素細胞系K562/ADM（由中國上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供），CCK-8試劑盒（購自中國碧云天公司），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒、增加通透性試劑盒（購自BD公司），Hoechst33258（購自美國Sigma公司），總miRNA提取試劑盒、TaqMan探針、逆轉錄試劑盒（購自美國Applied Biosystems公司），總RNA提取試劑盒（購自中國天根生化科技有限公司），miRNA-146a mimic、miRNA-con的慢病毒載體及miRNA-146a inhibitor（購自德國Qiagen公司），LipofectamineTM2000（購自美國Invitrogen公司），抗鼠CXCR4-PE抗體（購自美國eBioscience公司），CXCR4及β-actin抗體（購自中國Abcam公司），辣根過氧化物酶（購自中國Boster公司），Transwell小室（購自美國Corning公司）。

1.2 細胞培養

將2種細胞懸浮于含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素雙抗完全培養基中并接種在培養瓶，維持細胞密度為1×105個/ml，置于二氧化碳CO2體積分數為5%，飽和濕度90%的37℃培養箱中連續培養。在K562/ADM細胞培養液中加入5 mg/ml的ADM維持細胞系的耐藥性，實驗前用無ADM培養基至少培養2周。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8檢測運用藥物干預2種細胞前，在96孔板中調整細胞濃度為5.0×103個/孔，培養24 h。按CCK-8說明書用移液槍吸取100 μl細胞懸液加入96孔板中，同時設置對照組（加入等量培養液）和空白調零組，每組設3個復孔，每孔再加10 μl的CCK-8溶液，在450 nm處用酶標儀測量各孔的OD值求得均值計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。半數抑制率計算采用SPSS 11.0統計學軟件分析（LOGIT方法），耐藥逆轉倍數=空白對照組IC50/逆轉組 IC50。

1.3.2 細胞克隆形成實驗將K562/ADM細胞懸浮于含有不同濃度大黃素甲醚的RPMI 1640瓊脂糖混合物中，并接種于底面鋪有RPMI 1640瓊脂糖固體培養基的6孔板中。不更換新鮮培養基，將其置于溫度為37℃，飽和濕度95%、CO2體積分數為5%的培養箱中，連續培養14 d。選取超過50個細胞的細胞團計數并用結晶紫染色，細胞拍照記錄。

1.3.3 流式細胞術及Hoechst 33258檢測細胞凋亡用不同濃度的大黃素甲醚干預K562/ADM 48 h，收集細胞用預冷的PBS洗滌細胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，按每份100 μl的細胞懸液進行分裝備用。每個樣本加入2 μl的Annexin V-FITC和2 μl的PI染色混勻后，避光，室溫孵育5 min；上機前加入400 μl的Binding Buffer，流式細胞儀對1×104個細胞進行分析。Annexin V-FITC陽性的細胞為進行性凋亡的細胞，而FITC陰性細胞為存活的細胞。

Hoechst33258同樣被用來檢測凋亡細胞，細胞與Hoechst33258的高親和力表明細胞凋亡。處理后的K562/ADM細胞經PBS洗滌后每孔加入500 μl預冷的乙醇固定10 min。然后加入1 μmol/L Hoechst 33258染色10 min后用熒光顯微鏡進行觀察。200個細胞在3個隨機選擇的區域被計數并計算凋亡細胞核染色的發生率。

1.3.4 miRNA-146a下調、過表達及測定K562/ADM或K562細胞接種在96孔板中孵育過夜，然后根據LipofectamineTM2000說明書將細胞與miRNA-146a mimic、miRNA-146a抑制劑及空白的miRNA-con載體進行轉染。轉染效率用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）進行分析確定。

在miRNA檢測中，應用總miRNA提取試劑盒提取總miRNA，miRNA-146a通過探針qRT-PCR檢測。應用總RNA提取試劑盒從細胞中提取總RNA，逆轉錄為cDNA，qRT-PCR法擴增目的基因和內參照基因人GAPDH，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司根據已發布的序列[9]合成。應用比較ΔCt法對qRT-PCR結果進行分析。

1.3.5 siRNA下調CXCR4的表達CXCR4 siRNA寡核苷酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司根據已發布的序列[10]合成，同時設計合成1條競爭序列作為對照。取對數生長期的K562/ADM細胞接種于6孔板中，調整細胞密度為3×105個/ml，孵育過夜，根據LipofectamineTM2000說明書將細胞與siRNA載體及競爭的siRNA載體進行轉染。轉染后的細胞繼續孵育48 h后用Western blot分析其下調作用進行驗證。

處理后，收集K562/ADM細胞加裂解液至冰上30 min后粉碎細胞，收集蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上。蛋白經特殊的一抗和抗兔多克隆抗體處理后被檢測，β-actin作為內參照，經TBST再次清洗后加入辣根過氧化物酶進行檢測。信號檢測使用化學發光底物，結果用Band Scan軟件進行分析。

1.3.6 細胞表面CXCR4的表達在使用增加通透性的試劑盒之前先用抗鼠CXCR4-PE抗體固定K562/ADM細胞，然后用同樣的抗體對細胞進行第2次固定。使用FACS Calibur和Flow Jo軟件對結果進行分析。

1.3.7 質粒的構建及熒光素酶活性的檢測①質粒的構建參考文獻[11]。利用人基因組特定引物通過PCR對包括3'-UTR的片段進行擴增（正向5'-G CTCTAGACACAGATGTA-AAAGAC-3'；反向 5'-GCTC TAGACCACTGGTACAAAATCTTTATGTAAG-3'），并且插入1個pGL3載體到反向熒光素酶基因的終止密碼子，從而引起pGL3-3'-UTR/CXCR4的構成。②熒光素酶活性的檢測。293T受體細胞暫時性地與0.2 μg的pGL3-3'-UTR/CXCR4結構結合，0.02 μg的pRL-TKRenilla熒光素質粒包含標準化的Renilla熒光素及5 pmol的miRNA-146a的過表達或對照質粒。轉染24 h后溶解，根據設備說明書用雙熒光素酶分光光度計檢測系統進行熒光素酶的活性測量。

1.3.8 遷移實驗K562/ADM經不同濃度的大黃素甲醚干預48 h后收集細胞，調整細胞濃度為5×105個/ml。將細胞懸液放于上層小室，100 ng/ml CXCL12放在下層小室。隨后孵育8 h，未遷移的細胞在表面被移除，遷移細胞染色計數。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-146a在K562/ADM細胞中的表達

根據CCK-8分析，K562細胞和K562/ADM細胞經ADM干預48 h后的IC50分別為0.15和3.50 μmol/L，K562/ADM細胞的耐藥倍數是K562細胞的23倍多，見表1。與K562細胞比較，K562/ADM細胞中miRNA-146a的表達較低，表明miRNA-146a在K562細胞對ADM的獲得性耐藥中具有重要作用。見表2。

2.2 下調miRNA-146a對K562細胞ADM抵抗性的影響

轉染miRNA-146a inhibitor后miRNA-146a的表達水平降低。細胞生存實驗表明下調miRNA-146a后的K562細胞的生存率高于K562細胞及對照組（IC50分別為2.80、0.15及0.18 μmol/L，見表1）。另外，流式細胞術同樣顯示下調miRNA-146a能增強K562細胞抵抗ADM誘導的凋亡（見表3和圖1），總的來說，該結果顯示miRNA-146a與K562細胞對ADM耐藥有關。

表1 ADM干預48 h的IC50 （n =3，μmol/L，±s）

表1 ADM干預48 h的IC50 （n =3，μmol/L，±s）

IC50細胞系K562/ADM 3.50±0.30 K562/ADM+NC 3.20±0.15 K562 0.15±0.06 K562+NC 0.18±0.03 K562+miRNA-146a inhibitor 0.18±0.03 K562/ADM+miRNA-146a mimic 0.42±0.05 K562/ADM+大黃素甲醚（2 μmol/L） 1.70±0.30 K562/ADM+大黃素甲醚（5 μmol/L） 0.68±0.12 F值 93.679 P值 0.000

表2 miRNA-146a在K562/ADM及K562細胞中的表達（n =3，±s）

表2 miRNA-146a在K562/ADM及K562細胞中的表達（n =3，±s）

細胞系 miRNA K562 0.98±0.03 K562/ADM 0.29±0.02 t值 33.147 P值 0.000

2.3 上調miRNA-146a對K562/ADM細胞ADM敏感性的影響

miRNA-146a的作用通過應用miRNA-146a mimic被進一步研究。與K562/ADM細胞及轉染空白質粒的K562/ADM細胞比較，轉染miRNA-146a mimic的K562/ADM細胞中的miRNA-146a表達增高，見表4和圖2。CCK-8檢測顯示K562/ADM細胞轉染miRNA-146a mimic以后，與K562/ADM細胞及轉染空白質粒的K562/ADM細胞相比能增強K562/ADM細胞對ADM的敏感性（IC50為0.42、3.50和3.20 μmol/L，見表1）。相應地，上調miRNA-146a能使K562/ADM細胞對ADM誘導凋亡的作用更敏感。

2.4 調節miRNA-146a對K562細胞ADM耐藥的影響

下調或者上調K562細胞中的miRNA-146a未能引起P-gp或者MRP-1的mRNA的改變。相反，miRNA-146a的表達與CXCR4 mRNA的表達呈負相關，見表5。另外，流式細胞術和Western blot分析也顯示miRNA-146a的表達與CXCR4的表達呈負相關（見表6和圖3）。qRT-PCR和Western blot結果顯示CXCR4 siRNA抑制CXCR4表達的增加是由miRNA-146a inhibitor引起的（見表7和圖4）。另外，通過miRNA-146a inhibitor的誘導下調CXCR4的表達能降低K562細胞的耐藥性（見表8和圖5），表明miRNA-146a通過CXCR4在K562耐藥細胞中發揮其功能。

表3 miRNA-146a在各組K562細胞中的miRNA表達及對細胞凋亡的影響 （n =3，±s）

表3 miRNA-146a在各組K562細胞中的miRNA表達及對細胞凋亡的影響 （n =3，±s）

細胞系 miRNA 細胞凋亡率/%K562 1.00±0.04 16.61±1.22 K562+NC 0.97±0.03 14.93±0.73 K562+miRNA-146a inhibitor 0.25±0.06 2.62±0.09 F值 266.016 258.755 P值 0.000 0.000

表4 miRNA-146a在各組K562/ADM細胞中的miRNA表達及對細胞凋亡的影響 （n =3，±s）

表4 miRNA-146a在各組K562/ADM細胞中的miRNA表達及對細胞凋亡的影響 （n =3，±s）

細胞系 miRNA 細胞凋亡率/%K562/ADM 0.97±0.07 12.31±1.20 K562/ADM+NC 0.95±0.05 15.34±2.34 K562/ADM+miRNA-146a mimic 2.69±0.21 48.11±6.45 F值 174.361 73.108 P值 0.000 0.000

圖1 miRNA-146a inhibitor干預后各組K562細胞的凋亡情況

圖2 過表達miRNA-146a對K562/ADM細胞凋亡的影響

2.5 大黃素甲醚對K562/ADM細胞ADM敏感性的影響

大黃素甲醚減少K562/ADM細胞的生存能力，且呈劑量依賴性。當K562/ADM細胞受到相同劑量大黃素甲醚干預時，孵育48 h的抗惡性細胞增生的作用比24 h更明顯。然而，當將大黃素甲醚的干預時間延長到72 h，未觀察到進一步的細胞抑制作用（見表1）。給予大黃素甲醚2和5 μmol/L干預48 h后并未顯示出對K562/ADM細胞毒性作用（生長抑制率＜10%），所以選擇該劑量檢查大黃素甲醚能否逆轉K562/ADM細胞的耐藥性。CCK-8結果顯示選用2和5 μmol/L濃度的大黃素甲醚干預細胞后能降低K562/ADM細胞對ADM的IC50，IC50分別從3.50 μmol/L降到1.70和0.68 μmol/L。結果顯示，大黃素甲醚能增強K562/ADM細胞對ADM的敏感性，耐藥逆轉倍數在2和5 μmol/L濃度下分別為2.03和5.30倍（見表1）。逆轉耐藥也可以經克隆形成實驗證實，與單獨用ADM干預的細胞比較，當大黃素甲醚和ADM聯合作用于K562/ADM時，細胞集落數及集落大為減少，支持大黃素甲醚能增強K562/ADM細胞對ADM的敏感性。見表10和圖6。流式細胞儀分析表明與單獨用ADM干預比較，大黃素甲醚濃度在2和5 μmol/L能增加K562/ADM細胞的凋亡，見表11和圖7A。另外，Hoechst染色也進一步表明通過大黃素甲醚能增強ADM誘導細胞凋亡的作用，見圖7B。雖然大黃素甲醚自身不能誘導凋亡，但是通過核凝結能明確其對K562/ADM細胞的凋亡具有影響。

表5 調節miR-146a對細胞中P-gp、MRP-1及CXCR4表達的影響 （n =3，±s）

表5 調節miR-146a對細胞中P-gp、MRP-1及CXCR4表達的影響 （n =3，±s）

P-gp mRNA MRP-1 mRNA CXCR4 mRNA K562 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.03 K562+NC 1.02±0.05 0.98±0.04 0.97±0.03 K562+miRNA-146a inhibitor 0.96±0.04 0.95±0.03 1.96±0.12 K562/ADM 1.00±0.04 1.00±0.06 0.98±0.03 K562/ADM+NC 0.98±0.04 0.94±0.07 0.97±0.03 K562/ADM+miRNA-146a mimic 1.02±0.04 0.95±0.03 0.49±0.09 F值 1.058 0.836 160.149 P值 0.429 0.549 0.000細胞系

表6 CXCR4在各組K562和K562/ADM細胞中的表達 （n =3，±s）

表6 CXCR4在各組K562和K562/ADM細胞中的表達 （n =3，±s）

CXCR4的相對蛋白表達量K562 0.98±0.05 1.00±0.05 K562+NC 0.97±0.05 1.04±0.07細胞系 表面CXCR4的相對表達量K562+miRNA-146a inhibitor 2.25±0.26 1.85±0.17 K562/ADM 1.00±0.03 1.00±0.02 K562/ADM+NC 1.03±0.07 0.96±0.05 K562/ADM+miRNA-146a mimic 0.35±0.12 0.43±0.05 F值 74.915 89.579 P值 0.000 0.000

表7 miRNA-146a調節CXCR4對K562細胞ADM 耐藥性的影響 （n =3，±s）

表7 miRNA-146a調節CXCR4對K562細胞ADM 耐藥性的影響 （n =3，±s）

CXCR4蛋白表達無處理組 0.99±0.13 0.96±0.08組別 CXCR4的mRNA表達miRNA-146a inhibitor 1.96±0.12 2.06±0.19 miRNA-146a inhibitor+Control siRNA 1.87±0.15 1.96±0.26 miRNA-146a inhibitor+CXCR4 siRNA 1.29±0.13 1.19±0.16 F值 7.831 26.696 P值 0.009 0.000

圖3 CXCR4在K562或K562/ADM細胞中的表達及與miRNA-146a表達的關系

圖4 miRNA-146a inhibitor轉染的K562細胞中CXCR4的蛋白表達經CXCR4 siRNA降低

表8 miRNA-146a及CXCR4對K562細胞凋亡及活性的影響 （n =3，%，±s）

表8 miRNA-146a及CXCR4對K562細胞凋亡及活性的影響 （n =3，%，±s）

組別 細胞活性 細胞凋亡率無處理組 98.45±6.11 1.92±0.21 ADM（0.1 μmol/L） 57.34±6.23 16.62±2.53 ADM（0.1 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor 87.22±9.42 2.64±0.52 ADM（0.1 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor+Control siRNA 82.46±12.33 3.22±0.64 ADM（0.1 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor+CXCR4 siRNA 68.34±9.25 13.91±2.33 F值 9.525 7.750 P值 0.002 0.004

2.6 大黃素甲醚調節miRNA-146a和干預CXCL 12/CXCR4信號對K562/ADM細胞耐藥的影響

結果表明，大黃素甲醚干預能導致K562/ADM細胞中miRNA-146a水平呈劑量依賴性增加，見表12。除此以外，本研究結果還表明大黃素甲醚增強敏感性的作用經miRNA-146a inhibitor干預后幾乎完全消失，表明大黃素甲醚通過調節miRNA-146a逆轉K562/ADM細胞的多藥耐藥（見表13和圖8）。與大黃素甲醚對miRNA-146a的影響相一致，大黃素甲醚干預導致K562/ADM細胞中趨化因子受體CXCR4的表達呈劑量依賴性降低（見表14和圖9）。另外，遷移試驗結果顯示經大黃素甲醚干預后遷移受損（見表15和圖10）。大黃素甲醚通過上調miRNA-146a調節CXCR4的表達且干擾CXCR12與CXCR4的結合。

圖5 miRNA-146a及CXCR4對K562細胞凋亡的影響

圖6 單細胞克隆實驗檢測大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞活性的影響

表9 不同濃度的大黃素甲醚對K562/ADM細胞活性的影響 （n =3，±s）

表9 不同濃度的大黃素甲醚對K562/ADM細胞活性的影響 （n =3，±s）

大黃素甲醚的濃度 細胞活性/%0 μmol/L 96.21±5.01 2 μmol/L 92.03±7.32 5 μmol/L 84.12±6.45 10 μmol/L 77.08±10.34 F值 97.678 P值 0.000

表10 大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞活性的影響 （n =3，±s）

表10 大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞活性的影響 （n =3，±s）

細胞克隆數無藥物組 100±6 ADM（1.5 μmol/L） 78±9 ADM（1.5 μmol/L）+2 μmol/L 大黃素甲醚 62±8 ADM（1.5 μmol/L）組 +5 μmol/L 大黃素甲 42±6 F值 33.382 P值 0.000組別

圖7 大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞凋亡的影響

表11 大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞凋亡的影響 （n =3，±s）

表11 大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞凋亡的影響 （n =3，±s）

細胞克隆數無藥物組 1.61±0.23 ADM（1.5 μmol/L） 12.33±1.62 ADM（1.5 μmol/L）+2 μmol/L 大黃素甲醚 22.43±3.62 ADM（1.5 μmol/L）+5 μmol/L 大黃素甲醚 38.12±5.64 F值 68.015 P值 0.000組別

表12 大黃素甲醚干預下K562/ADM細胞中miRNA-146a miRNA 的相對表達量 （n =3，±s）

表12 大黃素甲醚干預下K562/ADM細胞中miRNA-146a miRNA 的相對表達量 （n =3，±s）

大黃素甲醚的濃度 miRNA-146a miRNA的相對表達量0 μmol/L 1.03±0.12 2 μmol/L 1.26±0.16 5 μmol/L 1.69±0.21 F值 12.011 P值 0.008

表13 K562/ADM細胞中降低miRNA-146a后大黃素甲醚對細胞活性及凋亡的影響 （n =3，±s）

表13 K562/ADM細胞中降低miRNA-146a后大黃素甲醚對細胞活性及凋亡的影響 （n =3，±s）

細胞凋亡率/%無藥物組 99.61±4.11 1.62±0.21 ADM（1.5 μmol/L） 61.09±6.5412.62±3.63組別 細胞活性率/%ADM（1.5 μmol/L）+大黃素甲醚（5 μmol/L） 21.23±4.0538.46±5.25 ADM（1.5 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor 67.34±8.33 9.32±1.04 ADM（1.5 μmol/L）+大黃素甲醚（5 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor 53.03±6.0123.21±2.13 F值 67.886 63.231 P值 0.000 0.000

表14 大黃素甲醚對K562/ADM細胞中CXCR4 表達的影響 （n =3，±s）

表14 大黃素甲醚對K562/ADM細胞中CXCR4 表達的影響 （n =3，±s）

CXCR4的蛋白相對表達量0 μmol/L 0.98±0.02 1.00±0.03 2 μmol/L 0.72±0.16 0.67±0.12 5 μmol/L 0.35±0.04 0.32±0.09 F值 32.685 44.474 P值 0.001 0.000大黃素甲醚的濃度 CXCR4的 mRNA相對表達量

圖8 K562/ADM細胞中降低miRNA-146a后大黃素甲醚對ADM誘導的細胞凋亡的影響

圖9 大黃素甲醚對K562/ADM細胞中CXCR4蛋白表達的影響

表15 大黃素甲醚對CXC12和CXCR4結合的影響（n =3，%，±s）

表15 大黃素甲醚對CXC12和CXCR4結合的影響（n =3，%，±s）

細胞遷移率無藥物組 100±6 CXCL12（100 ng/ml） 195±21 CXCL12（100 ng/ml）+2 μmol/L 大黃素甲醚 121±16 CXCL12（100 ng/ml）+5 μmol/L 大黃素甲醚 106±9 F值 28.408 P值 0.000組別

3 討論

作為一組高度保守非蛋白編碼的RNAs，miRNA能調節真核細胞中各種各樣目標基因的表達，因此，其在細胞增殖、凋亡、發展及分化中具有重要作用。miRNA-146a第1次發現于先天免疫和炎癥反應的微生物感染中，現在已經被發現在致癌作用和實體腫瘤的發展和轉移中具有重要作用[12-13]。其在基因敲除小鼠骨髓和淋巴惡性腫瘤中已經被發現[14]。GARZON等已經發現miRNA-146a在骨髓CD34+細胞正常的捐贈者中表達相對較高的水平，然而在急性髓系白血病患者中低表達，甚至在來自健康捐贈者的外周血或骨髓中的單核細胞、粒細胞、紅細胞、巨核細胞中的表達水平更低[15]。XU等也報道，miRNA-146a作為癌基因在急性早幼粒細胞白血病中的作用及其通過抑制Smad4有助于miRNA-146a的增高[16]。然而，miRNA-146a在CML的作用仍有待闡明。筆者的研究結果表明，miRNA-146a在耐藥K562/ADM細胞中的表達低于對藥物較敏感的K562細胞，上調miRNA-146a通過抑制趨化因子受體CXCR4的表達能恢復K562/ADM細胞對ADM的敏感性，大黃素甲醚通過上調miRNA-146a抑制CXCR4表達而增加K562/ADM細胞對ADM的敏感性。

越來越多的數據表明，miRNA因為其調節耐藥相關基因的能力而參與在化療耐藥的腫瘤治療中。miRNA-146 a與耐藥性腫瘤細胞的相關性也在一些研究中被描述。與MCF-7敏感細胞比較，在順鉑耐藥性乳腺癌MCF-7細胞中miRNA-146a上調[17]。在肝癌細胞的一項研究中發現，耐IFN-α細胞中miRNA-146a的表達高于IFN-α敏感細胞[10]。ZHUO等在另一項關于肝癌細胞的研究中報道miRNA-146a在耐藥細胞系中上調[18]。在結直腸癌中miRNA-146a的高表達與西妥昔單抗耐藥性和預后較差相關[19]。然而，相反的結果報道，miRNA-146a被發現在耐順鉑卵巢癌A2780細胞中低水平表達，盡管miRNA-146a inhibiter無法建立A2780細胞的耐藥性[20]。在非小細胞肺癌細胞中miRNA-146a的低表達與前期臨床TNM分期及遠處轉移相關聯[21]。另外，最近的研究表明，miRNA-146的藥物誘導能增強替莫唑胺誘導人類膠質母細胞瘤細胞凋亡的敏感性[22]。

本研究發現，miRNA-146a在耐ADM的K562細胞中的表達降低。此外，在敏感的K562細胞中轉入miRNA-146a inhibiter后表明細胞抵抗ADM誘導凋亡，而轉染miRNA-146a mimic的K562/ADM細胞則恢復其對ADM的敏感性。還發現miRNA-146a能提高K562細胞對ADM的耐藥性。筆者推測miRNA-146a誘導耐藥性的作用在不同腫瘤中有特定的作用。鑒于miRNA-146a在癌細胞中的目標不止1個信號通路，miRNA-146a是否促進或抗耐藥可能取決于調節癌細胞的特定關鍵信號通路。

CXCR4是在造血細胞和上皮癌細胞上表達的趨化因子受體，已經發現其通過調節白血病細胞和間質細胞的相互作用，從而保護白血病細胞免于自發和化療所致的死亡。因此，CXCR4被認為是影響急性髓系白血病生存和耐藥白血病預后的一個關鍵因素。筆者的研究結果表明miRNA-146a與CXCR4的表達呈負相關。另外，通過下調miRNA-146a建立的K562細胞對ADM的抵抗性可以通過CXCR4 siRNA降低，這表明CXCR4是介導下調miRNA-146a產生ADM耐藥結果的關鍵因素。除此以外，筆者發現miRNA-146a直接針對CXCR4 mRNA的3'-UTR并抑制其表達，與最近的一項研究是一致的[23]。有趣的是，最近的一項研究報道CXCR43'-UTR的過表達抑制miRNA-146a的活性，從而提高乳腺癌MCF-7細胞中CXCR4的表達，表明通過miRNA-146a調節CXCR4可能并是想象的那樣簡單[10]。然而，miRNA-146a和CXCR4之間更復雜的關系及其在K562細胞耐藥性中的作用需要進一步的研究驗證。

大黃素甲醚在2005年作為活性成分在多孢菌屬的培養中被分離出來。后來的研究發現大黃素甲醚分別在人類乳腺癌細胞和宮頸癌細胞中能夠誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡[6，8]。另外，ELF等報道大黃素甲醚在裸鼠異種移植中通過抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶抑制癌癥細胞增殖和腫瘤生長[24]。在本研究中，筆者為大黃素甲醚對miRNA-146a調節效應及其逆轉耐藥的能力提供第1個證據，支持天然化合物可以針對多個信號通路發揮抗腫瘤效應的這個概念。

總之，本研究結果表明下調miRNA-146和上調CXCR4可能與K562/ADM細胞的耐藥性有關。另外，大黃素甲醚可以通過誘導miR-146a的表達抑制CXCL12/CXCR4信號從而逆轉K562/ADM細胞對ADM的耐藥性。鑒于大黃素甲醚對正常細胞的毒性較低，其可以考慮作為1個潛在的CML的候選輔助治療劑。

參 考 文 獻：

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