初發急性白血病患者骨髓乳腺癌耐藥蛋白基因表達及其與預后關系的研究

劉勁，李薇，段華新，羅科玲，周煦

（湖南省人民醫院 1.腫瘤科，2.血液科，3.重癥醫學科，湖南 長沙 410005）

急性白血病（acute leukemia，AL）是血液系統 造血干細胞的一種惡性克隆增殖性疾病，其起病急，惡性程度高，嚴重威脅人類生命健康。異常造血細胞的增殖分化異常導致正常血細胞減少，臨床主要表現為貧血、出血和感染等征象[1]。急性白血病的發生受多基因異常調控的疾病，許多基因包括KIT、FLT3、NPM1和CEBPA均在急性白血病中表達失調，且與疾病的療效及預后判斷中具有一定的價值[2]。急性白血病的化療耐藥是治療過程中遇到的一大難題，乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）基因編碼重要的膜轉運蛋白，在白血病多藥耐藥方面發揮重要的作用[3-4]，影響患者的療效和預后。目前尚無骨髓BCRP基因表達與急性白血病患者預后關系的研究報道。本研究擬通過實時定量PCR檢測初發急性白血病患者骨髓BCRP基因表達，隨訪患者預后，分析骨髓BCRP基因表達與急性白血病預后的關聯，為治療方案的制定和優化提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月-2014年12月入住我院血液內科的急性白血病患者67例。其中，男性36例，女性31例；年齡19～68歲，平均39.0歲，中位年齡40歲。入選患者均符合中華醫學會血液學分會制定的初發急性白血病的診斷標準[5]，并通過細胞形態學、組織化學染色及免疫學分型，其中AML 42例，ALL 25例。同時還選擇50例健康志愿者作為對照組。男性30例，女性20例；年齡20～65歲，平均36.2歲。白血病患者與健康志愿者在性別和年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 標本收集及骨BCRP基因表達檢測

取EDTA抗凝骨髓標本1ml，用生理鹽水稀釋2倍，緩慢加于2ml淋巴細胞分離液上，3000r/min離心20min，吸取單個核細胞層，并用生理鹽水洗滌3次后通過Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA，具體按Trizol說明書操作。將RNA濃度調整至1μg/μl，逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）合成cDNA后通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）（TaKaRa公司）檢測骨髓BCRP基因表達。所用引物序列如下：BCRP正向5'-GTTCTC AGCAGCTCTTCGGC-3'，反向5'-TCCTCCAGACACAC CACGGA-3'；β-actin正 向 5'-CCATTGGCAATGAG CGGTTC-3'， 反 向 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10μl，PCR正向引物（10μmol/L）0.2 μl，PCR反向引物（10 μmol/L）0.2 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，cDNA 1 μl，H2O 8.2 μl。qRT-PCR 在 ABI 7500儀進行，反應條件如下，95℃ 40 s，（95℃ 5 s、60℃ 35 s）×40個循環，記錄熔解曲線和解鏈溫度，每個樣品做3個復孔，并計算平均值。將健康志愿者的BCRP平均表達水平定義為1，通過白血病患者的2-ΔΔCt法計算得出患者骨髓BCRP基因表達[6]。

1.3 預后隨訪

從初次確診后開始隨訪，隨訪時間截止2016年9月，隨訪時間為1～35個月，中位隨訪時間為27個月。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，利用t檢驗比較組間差異；計數資料以百分比或率的形式表示，利用χ2檢驗進行分析；骨髓BCRP基因表達與患者生存期分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組BCRP基因表達比較

對67例白血病患者和50例健康志愿者的骨髓單個核細胞進行qRT-PCR檢測。白血病患者BCRP基因表達為（3.0±1.2），較健康志愿者（1.2±0.6）升高（P＜0.01），見表1。

表1 急性白血病患者和健康志愿者情況比較

2.2 不同BCRP基因表達的AL患者情況比較

依照白血病患者BCRP基因表達均值（3.0），將其分為BCRP高表達組（4.1±0.7）和BCRP低表達組（2.1±0.5），兩組間白血病患者年齡、性別和分型差異無統計學意義（P＞0.05）；BCRP高表達組白血病患者初始WBC計數較BCRP低表達組高，差異有統計學意義（P＜0.001），見表2。

2.3 不同BCRP基因表達的AL患者生存分析

AL患者的生存時間為25個月，其中BCRP高表達組急性白血病患者的中位生存時間為15個月，BCRP低表達組急性白血病患者的中位生存時間為31個月，兩組生存分析比較差異有統計學意義（Logrank=21.78，P＜0.05），見附圖。

表2 不同BCRP基因表達AL患者情況比較

附圖 AL患者BCRP基因高低表達組間的生存曲線

3 討論

隨著社會生活方式的改變及環境污染問題的日漸嚴重，AL的發生率呈現出上升的趨勢。而患者的療效和預后各異，這與疾病的年齡、分型或基因異常等因素相關，目前對于臨床AL預后判斷尚缺乏特異性的指標[7]。而對于化療的耐藥是影響白血病療效和預后的一個重要因素[8]，化療耐藥主要是受到ABC轉運蛋白超家族的調控[9]，BCRP作為其中的一種日益受到研究者的關注。

本研究中，筆者首先檢測AL組和健康志愿者骨髓BCRP基因表達情況，發現AL患者骨髓BCRP基因表達高于健康人（P＜0.01）。按照BCRP基因表達的均數值將白血病患者分為BCRP高表達組和BCRP低表達組，發現BCRP高表達組患者初始白細胞計數更高（P＜0.001），同時中位生存時間更短，生存分析比較有差異，提示骨髓BCRP基因表達水平可能作為一個AL患者預后判斷的的生物學標志物。

BCRP基因定位于染色體4q22.1，其編碼蛋白定位于細胞膜及細胞核，膜表面的BCRP能將化療藥物轉運出細胞外，從而細胞內藥物濃度，影響化療療效[10]。能夠影響氨甲喋呤和阿霉素等常用化療藥物，引起多藥耐藥的發生[11]。以往的研究也證實，急性白血病時BCRP基因表達升高[12]，與本研究中的結論一致，且不同的骨髓BCRP基因表達組之間患者初始白細胞計數以及生存率也有差異，表明骨髓BCRP基因表達對于AL預后預測有一定的價值。同時，qRT-PCR技術檢測基因表達水平，結果快速且準確，且易于臨床檢驗的開展[13]。

綜上所述，AL患者骨髓BCRP基因表達高于健康志愿者，且BCRP高表達患者的預后更差。骨髓BCRP基因表達對于AL的預后有著重要的意義，能為AL患者治療方案的制定和優化提供依據，并輔助判斷其預后，同時尚需更大樣本量的研究以明確骨髓BCRP基因表達與AL預后的相關性，進一步提高其臨床指導應用價值。

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