西安市耐異煙肼的結核桿菌耐藥性及分子特征分析＊

周愛萍，張敏，李文俠，張增賢，沙莎，董鴻智，胡群英

（1.西藏民族大學醫學院高原環境與疾病相關基因研究高校重點實驗室，陜西 咸陽712082；2.陜西省咸陽市肺科醫院 檢驗科，陜西 咸陽 712046；3.陜西省西安市胸科醫院 檢驗科，陜西 西安 710061）

結核病發病率在全球范圍內一直居高不下，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，發病率居世界第2位。異煙肼作為消滅結核分枝桿菌作用最強的全殺菌藥物，自1952年首次用于結核病的臨床治療以來一直是抗結核治療的首選藥物。近年來，結核分枝桿菌對異煙肼耐藥情況日益嚴重，給結核病的防治工作帶來巨大挑戰。2012年一項研究中，中國結核分枝桿菌異煙肼耐藥率為20.9%[1]，高于全球水平11.5%。異煙肼耐藥是結核菌多重耐藥的基礎，對異煙肼耐藥菌株的分子特征與其傳播之間的關系研究非常有意義。結核菌耐藥性的產生主要是由染色體DNA發生突變引起。目前已發現結核分枝桿菌耐異煙肼的相關基因有katG、inhA、aphC、oxyR、mabA、kasA等基因，其中以katG和inhA基因的突變關系最為密切[2-3]。95%的異煙肼耐藥與katG基因突變有關[4]，其中最常見是KatG S315T突變，不同地區的異煙肼耐藥臨床菌株發生突變的相關基因及突變頻率有差異[5]。

本研究擬對臨床分離結核分枝桿菌進行藥敏試驗并采用定向缺失多重PCR(deletion-targeted multiplex PCR，DTM-PCR)方法對異煙肼耐藥菌株進行的基因分型研究，分別利用多重等位基因特異PCR（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）和PCR-DNA測序方法對其katG315和inhA-15突變熱點進行檢測。了解西安市異煙肼耐藥臨床分離菌株的分子特征。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2011年1月-2011年12月西安結核病院住院患者的痰液標本117株，且確診為結核分枝桿菌異煙肼耐藥臨床菌株。經BACTAC MGIT960分枝桿菌快速培養系統培養并經過菌種鑒定。標準菌株H37Rv由國家參比實驗室提供作為對照株。2×Taq PCR Master Mix、Taq酶（購自北京天根生化科技有限公司），三磷酸脫氧核苷（購自美國Sigma公司），DNA ladder（購自加拿大MBI Fermentas公司），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗按照全自動快速分枝桿菌培養系統說明書進行操作，分別在MGIT960培養管中加入鏈霉素、異煙肼、利福平和乙胺丁醇，使其終濃度分別為1.0、0.1、1.0 及 5.0 μg/ml。

1.2.2 分枝桿菌基因組DNA提取收集經BACTAC MGIT 960分枝桿菌快速培養系統培養及鑒定的異煙肼耐藥結核分枝桿菌臨床菌株，首先對培養管80℃水浴3 h滅活以消除管中結核分枝桿菌的傳染性。收集的菌體用水煮法提取結核分枝桿菌基因組DNA，具體步驟如下：200 μl TE緩沖液重懸菌體，100℃煮沸10 min，立即置于冰上5 min，12 000 r/min離心10 min，上清可直接用于PCR擴增。

1.2.3 MAS-PCR及PCR-DNA測序根據文獻[6-7]針對katG315和inhA-15合成MAS-PCR引物（katG-F/katG315-R、inhA-15-F/inhA-15-R）及PCR-DNA測序引物（katG-F/katG-R、inhA-F/inhA-R）（見表1）。為確保MAS-PCR結果的準確性，各隨機選擇10株MAS-PCR結果不同的菌株擴增目的片段并進行測序。katG315位點MAS-PCR反應條件為94℃預變性5 min，95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35個循環，最后72℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據目的片段的有無，判斷檢測是否存在突變。PCR-DNA測序反應條件為：94℃預變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，共30個循環，最后72℃延伸7 min。目的片段PCR擴增產物經電泳檢測后，送上海美吉生物技術有限公司進行序列測定，并將測序結果與GeneBank進行比對。

1.2.4 DTM-PCR基因分型根據文獻[6]合成3條用于DTM-PCR基因分型的引物（Beijng-P1，Beijing-P2，Beijing-P3）。H37Rv基因組DNA作為非北京型對照，PCR反應體系及條件參考文獻[7]進行。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據產物片段大小判斷其是否為北京型菌株。

表1 引物序列

2 結果

2.1 藥敏實驗結果

117株異煙肼耐藥菌株中，有73株為多重耐藥（62.39%），其中對4種一線抗結核藥物全部耐受有35株（29.91%），耐藥結果（見表2）。MDR-TB（多耐藥結核菌）同時耐受異煙肼和利福平的結核菌；PDRTB（多重耐藥結核菌），MDR-TB以外至少耐受2種抗結核藥物的結核菌（R：利福平；H：異煙肼；E：乙胺丁醇；S：鏈霉素）。

2.2 katG315和inhA-15位點突變

部分菌株MAS-PCR結果（見圖1）。117株異煙肼耐藥菌株中，81株（69.23%）存在katG315位點突變，10株（8.55%）存在inhA-15位點突變（其中3株檢測到雙位點突變）。在73株MDR-MTB菌株中，有49株存在katG315突變，5株存在inhA-15突變。MDR菌株中katG315突變菌株所占比例高于野生型菌株（67.12% vs 32.88%）。inhA-15突變菌株在MDR-MTB中的比例也高于其他耐藥菌株（6.85% vs 4.54%）。

2.3 DTM-PCR基因分型結果

表2 異煙肼耐藥菌株的藥敏結果 （n =117）

圖1 部分結核分枝桿菌katG315位點及inhA-15位點MAS-PCR結果

圖2 部分結核分枝桿菌DTM-PCR結果

部分菌株DTM-PCR結果（見圖2）。如其電泳條帶為1 500 bp判斷為非北京基因型菌株，電泳條帶為786 bp判斷為北京基因型菌株。117株異煙肼耐藥菌株有104株為北京型（88.89%），13株為非北京型菌株。

3 討論

作為一個全球公共衛生問題，結核病目前嚴重威脅著人類的健康。目前抗結核病一線藥物有4種（異煙肼、利福平、鏈霉素及乙胺丁醇）。當前，全球結核病耐藥形勢異常嚴峻，多重耐藥結核分枝桿菌（MDR-MTB，至少同時耐受異煙肼和利福平的結核桿菌）比例居高不下，結核菌耐藥菌株的產生和播散使結核病的防治困難重重。本研究通過對來自西安市結核病院的117株異煙肼耐藥臨床菌株耐藥性分析，發現目前西安市結核桿菌耐藥形勢的嚴峻性，應引起有關部門重視。

異煙肼是1912年首次合成的1種酰肼類化學藥物，其抗菌作用非常強。但近年來結核分枝桿菌INH耐藥性及耐多藥性呈上升趨勢。2014年世界衛生組織報告INH耐藥情況在新發病例中占8.1%，在經治病例中占14.0%。我國INH耐藥情況更是嚴重，根據2010年我國進行第5次全國結核病流行病學抽樣調查結果顯示，INH初始耐藥率為28.2%，獲得性耐藥率為30.8%[7]。

結核菌耐藥性產生主要是由染色體DNA發生突變引起。與異煙肼耐藥關系最為密切基因突變位點為katG315位點。katG基因是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因，315位點是katG與活性密切相關的位點，該位置發生突變可阻礙katG活性位點的甲基化，從而影響INH與katG結合，導致INH不能被活化，失去對結核桿菌的殺傷作用。該類型突變在耐受異煙肼結核桿菌中占50%～90%，并且與高濃度異煙肼耐受相關[8]。

研究表明，世界各地結核分枝桿菌katG315位點突變菌株流行與結核病流行相一致。與結核病低負擔地區相比，結核病高負擔地區katG315位點突變菌株更為流行。在我國不同地區間，該位點突變在異煙肼耐藥菌株中所占比例差別較大。2013年研究發現，合肥地區其比例為42.6%[9]，2010年中國東部農村一項研究中，異煙肼耐藥菌株中，存在該位點突變的菌株為61.8%[10]。本研究117株異煙肼耐藥菌株中，有81株（69.23%）存在katG315位點突變，與南非報道水平相當（64%），高于巴塞羅納（55%）、新加坡（26%）及芬蘭（7%）等地區，而低于俄羅斯西北部地區（93%）。西安地區異煙肼耐藥臨床菌株以katG315突變為主，提示該地區結核病疫情嚴重。

活化INH作用于細菌胞壁脂肪酸合成的靶位有多個，inhA蛋白是公認的原始靶位。有文獻報道該基因及其啟動子區域突變在異煙肼耐受的結核菌株中占21%～24%，并且inhA-15位置突變比inhA編碼基因突變更為常見[11]。當inhA-15位點發生單個堿基置換后，其啟動子活性增強，使inhA基因過度表達，從而削弱INH殺菌效能。該位點發生突變的菌株通常與低濃度耐藥相關。本研究中117株異煙肼耐藥菌株中，有10株存在inhA-15位點突變，低于有關文獻報道的比例。

流行病學的研究方法能預測疾病暴發流行及其傳播模式。以結核分枝桿菌基因型分型技術為基礎的分子流行病學可研究結核菌株之間的遺傳學關系，有助于探討多種重要的流行病學問題。北京基因型菌株是結核分枝桿菌地域分布最為廣泛的菌株，大約占世界各地菌株13%，東亞50%。也是中國臨床MTB的優勢菌株。有研究表明，北京型菌株與耐藥性有一定相關性[12]，并具有更強的毒力和傳播性[13]。間隔區寡核苷酸分型法是鑒定北京基因型菌株的金標準，但該方法操作復雜、成本較高。本研究采用DTM-PCR法是高謙等人根據北京基因型菌株的特異分子標志RD105缺失區建立起來一種多重PCR反應，利用3條引物通過對RD105區檢測，簡單快速地鑒定北京型菌株[6]。本研究對117株異煙肼耐藥臨床菌株進行DTM-PCR分型，發現104株為北京型菌株。與中國其他地區一樣，北京型菌株是目前西安市流行的優勢菌株。

綜上所述，發現北京型菌株是西安市異煙肼耐藥臨床菌株的主要基因型，其藥敏特性以MDR為主，引起耐藥的主要突變為katG315位點突變。鑒于目前西安市結核桿菌耐藥形勢的嚴峻性，強烈建議充分調動各方面力量，加大結核病防治工作力度，重視耐藥菌株監測，加強用藥合理性和全程性，及時遏制耐藥菌株的流行和傳播。

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