牛蒡子苷元對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝炎的保護(hù)作用

[摘要] 目的 研究牛蒡子苷元（ATG）對(duì)刀豆蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎的保護(hù)作用。方法 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成DMSO組、ConA/DMSO組、ConA/ATG組，每組10只小鼠。DMSO組和ConA/DMSO組小鼠腹腔注射DMSO，ConA/ATG組小鼠腹腔注射等體積ATG（30 mg/kg），5 h后ConA/DMSO組和ConA/ATG組尾靜脈注射ConA（20 mg/kg）。12 h后處死小鼠，取血清和肝臟組織，用生化分析儀測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，蘇木精-伊紅（HE）染色檢測(cè)肝組織病理?yè)p傷，TUNEL染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡，ELISA方法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）水平，q-PCR方法檢測(cè)肝組織中TNF-α和IFN-γ mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞（MDSCs），生化法檢測(cè)肝臟勻漿丙二醛（MDA）和髓過(guò)氧化物酶（MPO）的表達(dá)水平。結(jié)果 與DMSO組相比，ConA/DMSO組血清ALT和AST水平明顯升高（F=125.80、94.74，P<0.05）；肝臟組織損傷明顯加重；肝細(xì)胞凋亡增加；血清和肝組織中TNF-α和IFN-γ水平升高（F=17.52、68.81，P<0.05）；肝臟MDSCs募集活化降低；同時(shí)MDA和MPO活性升高（F=13.38、14.78，P<0.05）。與ConA/DMSO組比較，ConA/ATG組血清ALT和AST水平明顯降低（F=125.80、94.74，P<0.05）；肝臟組織損傷明顯減輕；肝細(xì)胞凋亡減少；血清中TNF-α和IFN-γ的水平降低（F=17.52、68.81，P<0.05）；肝組織中TNF-α和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平降低（F=31.55、14.64，P<0.05），MDSCs募集活化明顯增強(qiáng)；MDA和MPO活性降低（F=13.38、14.78，P<0.05）。結(jié)論 ATG對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎具有明顯的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 牛蒡子苷元；肝炎；刀豆蛋白A；腫瘤壞死因子α；干擾素γ

[中圖分類號(hào)] R575.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2018）03-0268-05

研究結(jié)果表明，自身免疫性肝炎和病毒性肝炎是人類主要的肝臟疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病[1-3]。急性肝炎的病因通常包括病毒感染、過(guò)度飲酒、自身免疫缺陷和藥物，免疫因素引起的肝臟損傷在肝炎發(fā)病過(guò)程中具有重要的作用。1992年TIEGS等[4]研究結(jié)果顯示，小鼠靜脈給予刀豆蛋白A（ConA）后，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，肝臟出現(xiàn)大面積損傷并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，用免疫抑制劑處理后肝臟損傷減輕。ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎發(fā)病機(jī)制及其病理過(guò)程與人類肝炎極其相似，因此該模型已被廣泛應(yīng)用于肝病研究中，對(duì)藥物的篩選及研發(fā)均具有重要的作用[5]。牛蒡子苷元（ATG）是一種木脂素成分，主要存在于菊科屬植物如牛蒡子、瓜蔞牛蒡、水母雪蓮和日本榧樹(shù)等中[6]。ATG在牛蒡子中含量較高，是牛蒡子的活性成分，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗結(jié)腸炎、免疫抑制和神經(jīng)保護(hù)等作用[7-10]。目前ATG對(duì)急性肝炎的保護(hù)作用機(jī)制尚不十分明確。本文研究以ConA誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠急性肝炎為模型，研究ATG對(duì)急性肝炎的保護(hù)作用并初步探討其機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

ATG（天津百倍生物公司）；ConA（Sigma公司，美國(guó)）；血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）ELISA試劑盒（BioLegend公司，美國(guó)）；TRIzol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；SYBR Green MasterMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）和髓過(guò)氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成生物研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物及模型建立 雄性、6～8周C57BL/6小鼠30只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中。隨機(jī)分成3組：DMSO組（A組）、ConA/DMSO組（B組）、ConA/ATG組（C組），各10只小鼠。ConA/ATG組和ConA/DMSO組小鼠分別給予腹腔注射ATG（30 mg/kg）和等量的DMSO，5 h后兩組小鼠均經(jīng)尾靜脈注射ConA（20 mg/kg），DMSO組小鼠腹腔注射DMSO。12 h后處死各組小鼠，分別收集眼球靜脈血和肝臟組織。

1.2.2 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測(cè) 小鼠血清送濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT和AST。

1.2.3 肝組織染色和TUNEL染色觀察 取同一部位肝臟固定于40 g/L多聚甲醛中，石蠟包埋、切片，厚度為5 μm。經(jīng)脫蠟和水化，行蘇木精-伊紅（HE）和TUNEL染色，觀察肝臟組織損傷程度和肝細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 血清TNF-α以及IFN-γ水平的測(cè)定 應(yīng)用ELISA方法，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.5 肝組織TNF-α和IFN-γ mRNA表達(dá)檢測(cè)

①肝組織RNA提取：取小鼠適量肝組織，以TRIzol法提取RNA，最后根據(jù)沉淀的量加入適量DEPC水溶解。上機(jī)檢測(cè)濃度并反轉(zhuǎn)錄，置于-80 ℃保存待用。②q-PCR檢測(cè)：TNF-α和IFN-γ引物均購(gòu)自上海生工生物工程公司，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。引物序列見(jiàn)表1。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green熒光標(biāo)記進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件根據(jù)說(shuō)明書(shū)設(shè)定，結(jié)果以2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟骨髓源性抑制性細(xì)胞（MDSCs） 提取肝臟單核細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記CD11b抗體和APC標(biāo)記Gr-1抗體，室溫孵育30 min，PBS清洗，離心（1 500 r/min，5 min），去上清，加入300 μL的PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 肝臟MDA和MPO測(cè)定 取小鼠肝臟組織于生理鹽水中清洗，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備50 g/L和10 g/L勻漿，檢測(cè)MDA和MPO活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用F檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝功能比較

與DMSO組相比，ConA/DMSO組小鼠血清中ALT和AST明顯升高；與ConA/DMSO組相比，ConA/ATG組血清ALT和AST明顯升高，差異均有顯著性（F=125.80、94.74，P<0.05）。見(jiàn)表1。HE染色顯示，與DMSO組相比，ConA/DMSO組肝組織中出現(xiàn)大片損傷；與ConA/DMSO組相比，ConA/ATG組肝損傷面積明顯減少。

2.2 各組肝細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色結(jié)果顯示，與DMSO組小鼠相比較，ConA/DMSO組小鼠出現(xiàn)大量肝細(xì)胞凋亡；與ConA/DMSO組比較，ConA/ATG組肝臟細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少。見(jiàn)圖1。

2.3 各組血清TNF-α和 IFN-γ水平比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與DMSO組小鼠相比較，ConA/DMSO組血清中TNF-α和IFN-γ濃度明顯升高；與ConA/DMSO組相比較，ConA/ATG組血清中TNF-α和IFN-γ濃度明顯降低，差異有顯著性（F=17.52、68.81，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組肝臟組織TNF-α和 IFN-γ mRNA表達(dá)比較

q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與DMSO組小鼠相比較，ConA/DMSO組肝臟組織TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平較明顯升高；與ConA/DMSO組相比，ConA/ATG組小鼠肝臟組織TNF-α和IFN-γ mRNA表達(dá)明顯降低，差異有顯著意義（F=31.55、14.64，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.5 各組肝臟MDSCs比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與DMSO組比較，ConA/DMSO組小鼠肝臟MDSCs募集活化減少；而與ConA/DMSO組相比較，ConA/ATG組小鼠肝臟中的MDSCs的比例明顯增加（圖2）。

2.6 各組肝組織中MDA和MPO比較

與DMSO組相比較，ConA/DMSO組MDA和MPO水平均上升；與ConA/DMSO組比較，ConA/ATG組MDA和MPO水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.38、14.78，P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

近年來(lái)中草藥治療肝臟疾病越來(lái)越廣泛地引起人們的關(guān)注[11]，ATG就是其中具有治療潛力的一種。ATG是牛蒡子的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性[7-10]。有研究表明，牛蒡子對(duì)四氯化碳和乙醇誘導(dǎo)的肝炎具有保護(hù)作用[12]，但是ATG對(duì)ConA誘導(dǎo)的急性肝炎的保護(hù)作用及機(jī)制還不明確。

ConA是T細(xì)胞的特異性有絲分裂原，在肝臟內(nèi)能迅速募集活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞，并分泌大量的炎性因子如TNF-α和IFN-γ等，在ConA誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)病過(guò)程中有重要作用[5，13-15]。TNF-α是介導(dǎo)肝炎發(fā)生的終末遞質(zhì)，與其受體結(jié)合進(jìn)而誘發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，也可激活中性粒細(xì)胞并促進(jìn)其發(fā)生趨化作用進(jìn)而聚集肝臟中，通過(guò)釋放蛋白酶和氧自由基促進(jìn)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在ConA誘導(dǎo)的急性肝炎發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，用抑制劑阻斷凋亡通路時(shí)，ConA誘導(dǎo)的急性肝炎明顯減輕[17]。另外，IFN-γ通過(guò)協(xié)同TNF-α促進(jìn)各種趨化因子和黏附分子的釋放發(fā)揮其病理作用[18-19]。研究顯示，用抗TNF-α和抗IFN-γ抗體預(yù)處理的小鼠或TNF-α和IFN-γ受體缺陷的小鼠均對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝損傷具有抵抗作用[18-19]。本文研究結(jié)果顯示，ConA/ATG組小鼠血清和肝臟中TNF-α和IFN-γ水平均較ConA/DMSO組顯著下降，而且肝細(xì)胞凋亡明顯減輕，提示ATG可抑制炎性因子的表達(dá)與釋放，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡對(duì)肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用。

MDSCs是一種免疫異質(zhì)細(xì)胞，包括未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）、巨噬細(xì)胞和其他髓系細(xì)胞。人類MDSCs在早期分化階段通常表達(dá)CD11b、CD33，低表達(dá)白細(xì)胞抗原DR，小鼠MDSCs通常表達(dá)CD11b和Gr-1[20-21]。肝臟血流豐富，含有大量的先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞亞型。有研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs在誘導(dǎo)肝臟免疫抑制方面發(fā)揮重要的作用，小鼠皮下接種腫瘤后大量的MDSCs流入肝臟[22]。還有研究結(jié)果顯示，MDSCs對(duì)ConA誘導(dǎo)的急性肝炎具有免疫抑制作用[23]。本文的結(jié)果顯示，與ConA/DMSO組比較，ATG預(yù)處理組肝臟中MDSCs細(xì)胞明顯升高，提示ATG通過(guò)募集活化MDSCs對(duì)ConA誘導(dǎo)的急性肝炎具有保護(hù)作用。

氧自由基是生物氧化還原反應(yīng)過(guò)程中的重要代謝產(chǎn)物，一般情況下，其產(chǎn)生和消除需要達(dá)到一定的平衡狀態(tài)，機(jī)體才能維持正常水平。氧化應(yīng)激的特點(diǎn)是脂質(zhì)過(guò)氧化增加或改變非酶和酶的抗氧化系統(tǒng)。MDA是膜磷脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞膜的完整性，檢測(cè)其含量可以間接反映細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度。MPO是一種內(nèi)源性溶酶體酶，主要存在于中性粒細(xì)胞中，可以清除H2O2并促進(jìn)具有毒性作用的次氯酸形成[25]。因此，檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和MPO含量可以了解肝臟損傷情況。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ConA/ATG組小鼠MDA和MPO活性較ConA/DMSO組均降低，差異有顯著性，說(shuō)明ATG可通過(guò)降低MDA和MPO的活性對(duì)肝臟發(fā)揮保護(hù)。

綜上所述，ATG可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及細(xì)胞凋亡、促進(jìn)MDSCs在肝臟募集、改善細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎發(fā)揮保護(hù)作用。但ATG保護(hù)作用的具體分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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