虎杖苷對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的干預(yù)研究

張新彧，黃 楊，孫紀(jì)元，徐云云

百草枯對人畜均有很強(qiáng)的毒性，因誤服或自服引起急性中毒屢有發(fā)生，已成為農(nóng)藥中毒致死事件的常見病因[1-2]。由于至今尚無有效解毒藥物[3]，許多治療方法雖取得了一些臨床效果，但中毒死亡率仍較高[4-5]，且絕大多數(shù)存活患者存在肺間質(zhì)纖維化而預(yù)后不良[6]。研究已發(fā)現(xiàn)，百草枯經(jīng)由能量依賴性多胺攝取進(jìn)入肺內(nèi)聚集，形成氧化還原循環(huán),產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，打破了自身氧化物及抗氧化物的平衡狀態(tài)；另一方面，各類炎性細(xì)胞的積聚,誘發(fā)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎性因子大量分泌，使肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控，最終導(dǎo)致肺組織脂質(zhì)過氧化加劇，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡上皮細(xì)胞凋亡[7-8]，這些是促使百草枯中毒急性肺損傷(ALI)形成的主要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以清除O2-及-OH，并對DPPH自由基、脂質(zhì)過氧化物都有抑制作用，且有濃度依賴性[9]。本實(shí)驗(yàn)用虎杖苷對急性百草枯中毒大鼠進(jìn)行治療，尋找切實(shí)有效的能緩解百草枯氧化損傷及抑制炎性因子釋放的理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及主要試劑 選用清潔級健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(250±20)g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號:SCXK(陜)2014-002,符合國家健康一級動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。藥品及試劑為20%百草枯、虎杖苷、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)均由南京建成生物工程研究所提供。TNF-α、IL-6由武漢伊艾博科技有限公司提供。

1.2動(dòng)物分組及模型制作 SD雌性大鼠60只，隨機(jī)分為正常對照組、染毒組和虎杖苷干預(yù)組，每組20只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，染毒組和虎杖苷干預(yù)組大鼠均以20%百草枯水劑按25 mg/kg一次性灌胃，建立百草枯中毒模型。虎杖苷干預(yù)組在染毒后60 min給予虎杖苷120 mg/kg灌胃，染毒組及正常對照組給予等量1 ml/kg生理鹽水灌胃，每日1次，共3 d。3組大鼠均按照原設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)(6、24、48、72 h，每次5只)處死，分別收集血清和肺組織標(biāo)本。

1.3觀察指標(biāo)和方法 在不同時(shí)間點(diǎn)處死相應(yīng)大鼠，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5～8 ml，4℃冰箱放置2 h，3000 r/min，離心10 min，取上清，分裝保存，于-80℃冰箱保存；采用生化法檢測血清中MDA、SOD活性和MPO水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清中TNF-α和IL-6水平；采血完畢后，每組大鼠同時(shí)取出右肺上葉拭干表面血液，精確稱量濕肺重量，再置于60℃烘箱中干燥48 h至重量恒定后，取出再次稱量計(jì)算肺干重，確定肺濕干比=肺濕重/肺干重。

2 結(jié)果

2.1肺組織濕干比 染毒組和虎杖苷干預(yù)組肺濕干比重隨著中毒時(shí)間延長而逐漸升高，在中毒24、48、72 h時(shí)高于正常對照組(P<0.01)。虎杖苷干預(yù)組24、48、72 h肺濕干比明顯低于染毒組(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺濕干比比較

注:與正常對照組比較,bP<0.01;與染毒組比較,dP<0.01

2.2血清中MDA、SOD和MPO水平 染毒組和虎杖苷干預(yù)組血清MDA、MPO水平在6、24、48、72 h高于正常對照組，血清SOD水平均低于正常對照組(P<0.01)。與染毒組比較，虎杖苷干預(yù)組血清MDA、MPO水平在6、24、48、72 h均明顯降低,血清SOD水平明顯增高(P<0.01)。見表2。

表2 3組不同時(shí)間點(diǎn)血清MDA、SOD和MPO水平比較

注:MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，MPO為髓過氧化物酶；與正常對照組比較，bP<0.01;與染毒組比較，dP<0.01

2.3血清中TNF-α和IL-6水平 染毒組和虎杖苷干預(yù)組血清中TNF-α和IL-6水平6、24、48、72 h高于正常對照組(P<0.01)；與染毒組比較，虎杖苷干預(yù)組6、24、48、72 h血清中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.01)。見表3。

表3 3組不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α和IL-6水平比較

注:TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白介素-6；與正常對照組比較，bP<0.01;與染毒組比較,dP<0.01

3 討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，百草枯主要通過肺泡Ⅱ型細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入肺內(nèi),使肺臟成為百草枯中毒的主要靶器官[10]，從而引起ALI和急性呼吸窘迫綜合征，最終使患者呼吸衰竭是百草枯中毒致死的主要原因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，百草枯一旦進(jìn)入人體后，可以逆濃度梯度差主動(dòng)重吸收到肺，并通過NADH依賴反應(yīng)形成氧化還原循環(huán)，首先導(dǎo)致各種有毒高活性氧自由基(H2O2、O2-、-OH)激增,誘導(dǎo)過度脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成過氧化產(chǎn)物MDA等，造成細(xì)胞膜和線粒體等部位產(chǎn)生損傷，其次,導(dǎo)致SOD及其他還原酶活性的降低和NADH等還原當(dāng)量的耗盡[10]，因而引發(fā)抗氧化防御能力失衡；另一方面，肺組織開始出現(xiàn)如中性粒細(xì)胞等各類炎性細(xì)胞積聚，使肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控，最終影響了生物氧化磷酸化，能量合成減少至停止，引起細(xì)胞衰竭，使依賴核苷酸生化反應(yīng)的肺表面活性物質(zhì)無法產(chǎn)生[12]，加速百草枯中毒的肺損傷。

自身氧化物及抗氧化物的平衡狀態(tài)標(biāo)志著正常的氧化應(yīng)激水平。多項(xiàng)百草枯中毒實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，MDA是多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物之一,是反映體內(nèi)氧自由基的代謝狀況及組織受自由基攻擊程度可靠指標(biāo)[13],其水平大幅升高，可以間接反映百草枯中毒肺損傷的程度[14]；SOD是機(jī)體二級抗氧化酶系統(tǒng)的標(biāo)志物，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化的作用，其活性下降反映機(jī)體抗氧化防御能力的降低[15]；MPO主要存在于多形核白細(xì)胞的嗜天青顆粒中，其活力是反映機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞活化、浸潤的可靠指標(biāo),升高可啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化，能夠較好反映致百草枯中毒早期肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[16]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，染毒組血清中MDA、MPO水平顯著升高，SOD水平顯著降低。提示百草枯中毒后早期氧自由基的清除能力下降，提示染毒動(dòng)物模型氧化應(yīng)激反應(yīng)較明顯，產(chǎn)生氧自由基而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，使生物膜進(jìn)一步受到MDA攻擊，抗氧化防御能力降低，使得氧化(MDA)-抗氧化(SOD)失衡，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。現(xiàn)代藥理學(xué)相關(guān)研究表明，虎杖苷在抗脂質(zhì)過氧化、抗炎免疫、抗肺損傷等方面的藥理作用被證實(shí)[9,17]。另有研究報(bào)道，虎杖苷能夠明顯抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，在體內(nèi)和體外發(fā)揮顯著的抗氧化能力[18]。本研究結(jié)果顯示，與染毒組比較，虎杖苷干預(yù)組血清中MDA、MPO水平均明顯降低，而SOD水平明顯增高，提示虎杖苷對百草枯中毒后肺損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)過程有一定的調(diào)節(jié)作用，可減少體內(nèi)ROS的生成，并可減少各種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，能有效延緩肺損傷的改變。

近年來,在ALI機(jī)制中,多種類型細(xì)胞及細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥肺組織損傷過程中所起的作用日益受到重視并成為研究的熱點(diǎn)。王鑫等[19]研究證實(shí)了百草枯可介導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生大量的白介素和TNF-α與肺組織的炎癥水平密切相關(guān)。相關(guān)研究證實(shí)，TNF-α是體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，其水平的增高，具有觸發(fā)進(jìn)一步炎性反應(yīng)的作用,被稱之為早期炎性反應(yīng)細(xì)胞因子。IL-6具有廣泛的生物學(xué)功能，在炎癥階段通過調(diào)節(jié)輔助淋巴細(xì)胞的活性,趨化粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的積聚,介導(dǎo)炎性反應(yīng)，從而又導(dǎo)致IL-6水平的升高[20-22]。在實(shí)驗(yàn)中，染毒組血清中TNF-α和IL-6水平均高于正常對照組，這是造成肺通透性增高，使肺水腫及透明膜形成，是肺濕干比升高的直接原因，最終導(dǎo)致肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控，與ALI的發(fā)生關(guān)系極為密切[23-24]。本研究結(jié)果顯示，虎杖苷干預(yù)組肺濕干比、血清中TNF-α、IL-6水平均明顯下降，再次證實(shí)了虎杖苷可在百草枯中毒致ALI中發(fā)揮抗炎、減輕水腫的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)與炎性因子均參與了百草枯中毒急性肺損傷的過程，虎杖苷干預(yù)后抑制了氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得炎性因子的水平降低，這種作用可能與MDA、SOD、MPO和TNF-α、IL-6有關(guān)，因而，虎杖苷對百草枯中毒導(dǎo)致的肺損傷有一定的治療效果，值得進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 曹玉芳，李景輝，歐宗興，等.二烯丙基硫化物可下調(diào)百草枯中毒大鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB蛋白及腫瘤壞死因子-α mRNA表達(dá)[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2015，27(4):274-279.

[2] 韓龍飛， 金紅旭.血液灌流聯(lián)合持續(xù)腎替代療法治療急性百草枯中毒療效分析[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學(xué)，2017，5(4)：224-227.

[3] 聶時(shí)南,黃昌保.百草枯中毒診治:現(xiàn)狀與前景[J].臨床急診雜志,2016,17(5):329-332.

[4] Noicharoen D, Parkpian P, Shipin O V,etal. Effect of salinity on adsorption and desorption of paraquat in Pak Phanang river sediment, Thailand[J].J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng, 2012,47(12):1897-1908．

[5] Lee Y， Lee J H， Seong A J，etal. Arterial lactate as a predictor of mortality in emergency department patients with paraquat intoxication[J].Clin Toxicol (Phila), 2012,50(1):52-56.

[6] 菅向東.急性百草枯中毒診治中應(yīng)注意的問題[J].臨床急診雜志,2015,16(10):742-745.

[7] 邵雪,陳江華.急性百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生機(jī)制及治療進(jìn)展[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,43(6):717-727.

[8] Xu L, Xu J, Wang Z. Molecular mechanisms of paraquat-induced acute lung injury: a current review[J].Drug Chem Toxicol, 2014,37(2):130-134.

[9] Wang H L, Gao J P, Han Y L,etal. Comparative studies of polydatin and resveratrol on mutual transformation and antioxidative effect in vivo[J].Phytomedicine, 2015,22(5):553-559.

[10] Qian J, Ye Y, Lv L,etal. FTY720 attenuates paraquat-induced lung injury in mice[J].Int Immunopharmacol, 2014,21(2):426-431.

[11] 王鸞,趙敏.急性百草枯中毒機(jī)制及治療進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2017,23(14):2790-2793，2799.

[12] Lopez-Rodriguez E， Boden C， Echaide M，etal. Surfactant dysfunction during overexpression of TGF-beta1 precedes profibrotic lung remodeling in vivo[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2016,310(11):L1260-1271.

[13] 孟瀟瀟,劉刊,談玖婷,等.百草枯中毒大鼠肺纖維化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué),2013,25(6):331-334.

[14] 張擁軍,侯云生.百草枯中毒的抗氧化應(yīng)激研究進(jìn)展[J].中國急救醫(yī)學(xué),2012,32(11):1054-1058.

[15] 張錫剛，魯曉霞，何躍忠.甲潑尼龍聯(lián)合環(huán)孢素A對百草枯中毒的防治[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2010,19(4):351-356.

[16] 張煒，孫海晨，邵旦兵，等.環(huán)磷酰胺對急性草枯中毒小鼠肺損傷的保護(hù)作用[J].中國急救醫(yī)學(xué),2010,30(11)：1001-1004,1057.

[17] 楊博,李蕾,韓彬,等.虎杖中虎杖苷的藥理研究新進(jìn)展[J].廣東化工,2017,44(4):58-60.

[18] Abernathy L M， Fountain M D， Rothstein S E，etal. Soy Isoflavones Promote Radioprotection of Normal Lung Tissue by Inhibition of Radiation-Induced Activation of Macrophages and Neutrophils[J].J Thorac Oncol, 2015，10(12):1703-1712.

[19] 王鑫，李兵，孫桂芹，等.烏司他丁對急性百草枯中毒大鼠血漿中炎性細(xì)胞因子及MDA、SOD影響的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，24(23):2527-2529,2616.

[20] 葛珊珊，陳建榮，薛壘喜，等.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征患者呼出氣冷凝液中TNF-α檢測的臨床意義[J].臨床急診雜志,2015,16(5):343-347.

[21] 王貴富,王寶中,盛延興,等.小鼠早期放射性肺損傷組織中單核細(xì)胞趨化蛋白1的表達(dá)及其意義[J].腫瘤研究與臨床,2016,28(6):369-372.

[22] 張敏,顏培夏,吳曉燕,等.跨肺壓法設(shè)置呼氣末正壓通氣對急性呼吸窘迫綜合征模型豬肺保護(hù)作用的研究[J/CD].中華重癥醫(yī)學(xué)電子雜志,2016,2(1):50-58.

[23] 黃波,江芬,薛萊,等.PPARβ在虎杖苷抗高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌肥大中的作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015,31(9):1264-1269.

[24] 李曉會,吳孟嬌,張麗娜,等.虎杖苷對小鼠膿毒癥模型 ALT、AST、TNF-α 及 COX-2 的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,33(2):225-228.