不同濃度辣椒素對缺氧復氧后A549細胞凋亡的影響*

曾結婷 王儒蓉 李雪寒 徐弋 成燕

(1.四川大學華西醫院麻醉科，四川 成都610041；2.重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科，重慶 400016)

辣椒素(capsaicin，cap)是辣椒植物屬的主要刺鼻成分，是紅辣椒的主要活性成分，可以對包括人類在內的哺乳類動物產生刺激性，而且在口腔中產生灼燒感[1]。它是一種香草素受體激動劑，可以激活瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)。辣椒素具有緩解疼痛[2]、抗氧化、抗炎和抗癌作用等特性[3]，而且辣椒素還在調節肥胖方面也起著重要作用[4]。近年研究發現辣椒素對內臟器官的缺血再灌注損傷具有保護作用，包括心臟[5]、腎臟[6]、腦[7]等。我們以前的研究發現，辣椒素可以減輕大鼠的肺缺血再灌注損傷，其機制與增加肺內神經肽類物質的釋放以及上調肺和腦干的TRPV1和神經肽類物質受體，從而緩解氧化應激和炎癥反應有關[8]。肺缺血再灌注損傷可發生于心肺復蘇術、肺移植、體外循環、肺動脈栓塞、肺的袖式切除、創傷等情況[9-10]，其主要損傷機制并不完全清楚，主要包括氧化應激，炎癥反應，細胞凋亡，細胞內鈣超載和神經源性炎癥等途徑[11-12]。細胞凋亡是缺血再灌注損傷的機制之一；肺缺血再灌注損傷會引起肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞以及支氣上皮細胞等發生凋亡。然而，目前仍然不清楚辣椒素如何影響肺缺血再灌注引起的肺內細胞凋亡。

肺泡Ⅱ型上皮細胞被認為是肺泡上皮的干細胞，肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖和分化不僅可以修復肺泡的正常結構，更能有效地進行功能上的恢復[13]。有文獻報道稱，辣椒素的使用可以降低大鼠海馬角質層神經元缺氧復氧后的細胞凋亡[14]；25～75μM辣椒素可以明顯減少谷氨酸誘導的皮質神經元凋亡，拮抗谷氨酸鹽對皮層神經元細胞的損傷作用[15]。本實驗擬建立離體A549細胞缺氧復氧模型，模擬在體肺缺血缺氧過程，探討不同濃度辣椒素對A549細胞缺氧復氧后增殖活力和細胞凋亡的影響。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及細胞 天然辣椒素及合成辣椒素標準品均購自美國sigma公司，CCK8試劑盒、Annexin-V-FITC/PI(熒光探針FITC標記的膜聯蛋白-5/碘化丙啶)雙染細胞凋亡檢測試劑盒均購自Keygen公司。A549細胞由四川大學生物治療國家重點實驗室惠贈，于37℃、5%CO2的普通培養箱中在含10% FBS的 DMEM培養基中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2 辣椒素的配制 用DMSO(Sigma公司)分別溶解天然辣椒素粉末和合成辣椒素標準品粉末，配成溶液，置于-20℃冰箱保存。臨用時，以DMEM稀釋天然辣椒素和合成辣椒素標準品成各種所需濃度(0.25μM，2.5μM，25μM，250μM，2500μM)。

1.3 A549細胞的培養與鑒定 A549細胞在含10% FBS的DMEM培養基中培養。取長滿培養瓶瓶底、生長狀態良好的A549細胞，棄掉培養基，加入適量PBS洗滌3遍，加入適量胰酶至細胞變圓，加入含胎牛血清培養基終止胰酶消化，吹打成細胞懸液，收集于EP管中，后1500r/min離心10分鐘，棄掉上清液，用4℃預冷PBS洗滌細胞3次，離心，去上清；用0.5%戊二醛固定，置于4℃冰箱中靜置10min；再10000r/min離心15分鐘，棄掉上清液，用3%戊二醛固定后送透射電子顯微鏡觀察(四川大學電鏡室)。

1.4 實驗分組 將培養的A549細胞隨機分為7組：正常培養細胞組(control組)、缺氧36小時復氧24小時組(HR組)、在缺氧前用5個不同濃度：0.25μMcap，2.5μMcap，25μMcap，250μMcap，2500μMcap處理，分別為cap0.25+HR組、cap2.5+HR組、cap25+HR組、cap250+HR組、cap2500+HR組。

Control組是正常培養的細胞，未經任何處理；HR 組是用含100U/mL青霉素-鏈霉素混合液的無糖Hank’s緩沖液，于37℃、1%O2、94%N2、5%CO2三氣培養箱中缺氧培養36小時后，然后放置于不含FBS的DMEM在37℃、5%CO2普通培養箱中復氧培養24小時；5個不同濃度辣椒素處理的cap+HR組在缺氧前加入0.25μM，2.5μM，25μM，250μM，2500μM辣椒素，其他處理與HR組相同。

各組細胞在培養后用倒置顯微鏡進行細胞形態學觀察。HR組、cap0.25+HR組、cap2.5+HR組、cap25+HR組、cap250+HR組、cap2500+HR組用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活力。Control組、HR組、cap25+HR組和cap250+HR組用Annexin-V-FITC/PI雙染色法后用流式細胞儀技術檢測細胞凋亡情況。

1.5 CCK8試劑盒檢測細胞增殖活力 本實驗采用CCK-8試劑盒(Keygen)進行定量測定評估A549缺氧復氧細胞增殖活力。以(1～5)×105/孔接種于96孔板中，將培養板放在37℃、5%CO2普通培養箱預培養24小時；在缺氧前加入0.25μM，2.5μM，25μM，250μM，2500μM辣椒素，其他處理與HR組相同；復氧結束后向每孔加入10μL 10%CCK8溶液，在37℃下孵育2小時；使用酶標儀(EPOCH2，Bio Tek)測定450nm處的吸光度。每個六個平行實驗樣品用于評估細胞活力。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 本實驗采用Annexin-V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。將control組、HR組、cap25+HR組、cap250+HR組A549細胞按照Annexin-V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書處理，收集上清液，用無EDTA-胰蛋白酶消化液消化收集貼壁細胞，加入上述上清液中，2000r/min離心3分鐘，棄掉上清液，PBS洗滌2次，1200r/min離心3分鐘，棄掉上清，加入300μL結合緩沖液，懸浮細胞，加入3μL Annexin-V-FITC混勻后，再加入3μL PI(Propidum Iodide，碘化丙啶)混勻，室溫避光反應5分鐘，在1小時內采用流式細胞儀(Navios)檢測細胞凋亡的百分率。

2 結果

2.1 A549細胞的鑒定 在透射電鏡下觀察，A549細胞表面有短小微絨毛，細胞核較大，核形不規則，核膜皺褶較多，核仁肥大，胞漿內含有多個吞飲小泡，見圖1A。另外，在胞漿內可見多個大小不一的圓形或卵圓形的年輪狀板層小體，其內容物呈螺紋狀排列，見圖1B。這是肺泡Ⅱ型上皮細胞的特征性結構，可以認為A549細胞具有肺泡Ⅱ型上皮細胞特性。

圖1 電子顯微鏡下A549細胞形態

Figure1ThemorphologyofA549cellsunderelectronmicroscope

注：A.A549細胞表面有短小微絨毛，細胞核明顯，胞漿內含多個吞飲小泡；B.胞漿內多個內呈螺紋狀排列的板層小體

2.2 辣椒素對缺氧復氧A549細胞形態學的影響 倒置顯微鏡下見control組細胞貼壁連接成片，平展呈多邊形，上清液干凈，見圖2A；HR 組細胞形態變圓，貼壁細胞數量減少，上清液中有較多的白色顆粒狀脫落細胞，見圖2B；cap25+HR組細胞貼壁成小片狀，細胞呈多邊形，貼壁細胞多于HR組，白色顆粒狀脫落細胞少于HR組，見圖2C；cap250+HR組細胞貼壁成小片狀，呈多邊形，貼壁細胞較HR組明顯增多，白色顆粒狀脫落細胞較HR組明顯減少，見圖2D。

圖2 倒置顯微鏡下各組的細胞形態 (×40)

Figure2Cellmorphologyofeachgroupunderinvertedmicroscope

注：A.control組細胞貼壁成片，上清液干凈；B.HR組細胞呈近圓形，貼壁細胞較少，有較多白色顆粒狀脫落細胞；C、D.cap25+HR組及cap250+HR組細胞貼壁成小片狀，白色顆粒狀脫落細胞較少

2.3 辣椒素對A549細胞缺氧復氧后增殖活力的影響 缺氧前加入0.25μM，2.5μM，25μM，250μM，2500μM天然辣椒素或者合成辣椒素標準品后，缺氧36小時復氧24小時，用CCK8試劑盒檢測A549細胞增殖活力。使用天然辣椒素處理A549細胞后，與HR組(細胞活力為1)比較，使用不同濃度天然辣椒素的各組的細胞增殖活力結果見表1。低濃度(2.5μM，25μM，250μM)天然辣椒素可一定程度促進缺氧復氧A549細胞增殖,但是高濃度(2500μM)天然辣椒素抑制細胞增殖。

使用合成辣椒素標準品處理A549細胞后，與HR組(細胞活力為1)比較，使用不同濃度合成辣椒素標準品的各組的細胞增殖活力結果如表1所示。合成辣椒素標準品對于A549細胞增殖活力的影響與天然辣椒素呈現相同的結果，低濃度(2.5μM，25μM，250μM)合成辣椒素標準品可一定程度促進缺氧復氧A549細胞增殖，高濃度(2500μM)合成辣椒素標準品抑制細胞增殖。

在cap0.25+HR組、cap2.5+HR組、cap25+HR組、cap250+HR組、cap2500+HR組，天然辣椒素和合成辣椒素標準品對A549細胞增殖活力影響比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 辣椒素對A549缺氧復氧后凋亡率的影響 缺氧前加入25μM、250μM天然辣椒素，缺氧復氧后流式細胞儀檢測A549細胞凋亡示意圖見圖3，表2。與control組比較，HR組、cap25+HR組、cap250+HR組缺氧復氧后細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與HR組比較，cap25+HR組和cap250+HR組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，分別減少約7.8%(25μM)和13.53%(250μM)，即缺氧前使用25μM和250μM辣椒素處理A549細胞均可降低缺氧復氧引起的凋亡，且高濃度(250μM)保護作用更明顯。

3 討論

細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，在形態學上表現為核固縮、染色體濃集和 DNA片段化至寡核苷酸化片段，但是細胞膜及細胞內細胞器保持相對完整[16]。

Table1Theviabilityofhypoxia-reoxygenationA549cellstreatedwithdifferentconcentrationsofnaturalandsyntheticcapsaicin

組別組別細胞活力細胞活力HR組11cap025+HR組112±017124±017cap25+HR組167±007①146±009①cap25+HR組186±013①172±025①cap250+HR組226±035①212±018①cap2500+HR組001±001①?004±001①

注：與HR 組，①P<0.05

圖3 流式細胞儀檢測結果示意圖Figure 3 Schematic diagram of results from flow cytometry

注：C1象限：Annexin-V-/PI+表示壞死細胞；C2象限. Annexin-V+/PI+表示中晚期凋亡細胞; C3象限：Annexin-V-/PI-表示存活細胞; C4象限. Annexin-V+/PI-表示早期凋亡細胞

表2 各組A549細胞的凋亡率Table 2 Cell apoptosis rate of each group

注：與control組比較，①P<0.05；與HR組比較，②P<0.05；與cap25+HR組比較，③P<0.05

肺泡Ⅱ型上皮細胞具有增殖功能，被認為是肺泡上皮的干細胞，其增殖和分化不僅可以修復肺泡的正常結構，更可以有效地進行功能上的恢復[13]。另外，肺泡Ⅱ型上皮細胞還具有合成和分泌肺泡表面活性物質及其相關蛋白以及免疫調節的作用[13]。因此，肺泡Ⅱ型上皮細胞的正常結構與功能對維持肺泡結構和功能及局部環境穩態具有重要作用。肺組織在缺血再灌注過程中會引起肺泡Ⅱ型上皮細胞發生凋亡，從而引起肺損傷[17]。A549細胞是來源于人肺腺癌的肺泡基底上皮細胞株，它可以在體外無限分裂而且具有肺泡Ⅱ型上皮細胞特性[18]。本實驗電鏡結果證實，A549細胞核明顯，胞漿內含有吞飲小泡，有大小不一的年輪狀板層小體，其內容物近似同心圓狀排列，此為肺泡Ⅱ型上皮細胞的特征性結構。因此，本實驗建立A549細胞缺氧復氧模型用于模擬體內肺缺血缺氧過程，觀察辣椒素對A549細胞缺氧復氧后細胞增殖及凋亡的作用，探討辣椒素對肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響。

缺氧復氧可以使得腫瘤細胞[19]、心肌細胞[20]、神經細胞[21]、上皮細胞等不同組織細胞發生凋亡，而且肺組織在缺血再灌注過程中會引起肺泡Ⅱ型上皮細胞發生凋亡[17]。為建立A549細胞缺氧復氧模型，本實驗參考Wang 等[22]的方法，當A549細胞生長達70%～80%培養板底時，更換培養液為含100U/mL青霉素-鏈霉素混合液的無糖Hank’s緩沖液，置于37℃、1%O2、94%N2、5%CO2三氣培養箱中缺氧培養不同時間(3～36h)；缺氧培養結束后，更換培養液為不含FBS的DMEM，置于37℃、5%CO2普通培養箱中復氧培養24h。預實驗結果示，經過缺氧36h復氧24h處理后，A549細胞發生凋亡的細胞為50%左右。與正常對照組比較，倒置顯微鏡下見貼壁細胞數量明顯減少，上清液中見呈白色顆粒狀脫落的細胞，貼壁細胞形態發生改變，細胞變圓或長出分支，有些細胞呈顆粒狀，細胞膜完整，但胞核脆裂。其他缺氧時間A549細胞的凋亡率與control組差異不如缺氧36h明顯。因此，本實驗選擇缺氧36h復氧24h建立A549細胞缺氧復氧模型。

研究顯示，不同濃度辣椒素對細胞凋亡的影響是不同的[23-24]。因此，本實驗參考Lin等[24]的方法選擇多個濃度的辣椒素(0.25μM、2.5μM、25μM、250μM、2500μM)進行細胞增殖活力的實驗，結果顯示低濃度(0.25μM)對缺氧復氧A549細胞活力無明顯影響，2.5μM、25μM、250μM辣椒素可增加缺氧復氧A549細胞的增殖活力，250μM最為顯著，高濃度(2500μM)不僅不能增加A549細胞活力反而起抑制作用。為了闡明辣椒素增加缺氧復氧A549細胞的增殖活力是否與減少缺氧復氧誘導的細胞凋亡相關，用Annexin-V-FITC染色并評估細胞凋亡率。基于CCK8檢測細胞增殖活力的結果，我們選擇用25μM和250μM辣椒素處理以檢測缺氧復氧A549細胞的凋亡。

本實驗所用的兩種辣椒素分別是從紅辣椒提取純化辣椒素純度達95%以上的天然辣椒素和用化學合成的方法得到的純度達99.99%的合成辣椒素標準品。從紅辣椒提取的辣椒素類物質，除了天然辣椒素，還有二氫辣椒素、降二氫辣椒素、高二氫辣椒素和高辣椒素等系列同類物[25]。本實驗選擇合成辣椒素標準品進行細胞增殖活力檢測的平行實驗，比較天然辣椒素與合成辣椒素標準品對缺氧復氧A549細胞的作用，從而排除二氫辣椒素等辣椒素類物質對缺氧復氧A549細胞的作用。本實驗結果顯示，在0.25～2500μM各個濃度組別中天然辣椒素和合成辣椒素標準品對A549細胞增殖活力的影響無差異。故后續檢測辣椒素對缺氧復氧A549細胞凋亡的影響選用了天然辣椒素。

有研究表明，25～75μM辣椒素可濃度依賴性地拮抗谷氨酸鹽對皮層神經元細胞的損傷作用，增加細胞活力且降低細胞凋亡率，60μM辣椒素處理后的皮層神經元細胞活力最高[15]；辣椒素可以濃度依賴性地顯著減少大鼠海馬角質層神經元缺氧復氧后的細胞凋亡，可能與細胞內ROS產生減少及抑制caspase-3活化有關[14]；還有研究表明，在體外小鼠紅藻氨酸誘導的癲癇模型實驗中發現，辣椒素可明顯減少細胞凋亡[26]。我們的結果與上述研究一致。不同的是，大量關于辣椒素對腫瘤細胞作用的研究中表明，辣椒素在體外和體內可抑制癌癥生長和進展，并誘導各種類型的癌細胞凋亡，從而產生抑制腫瘤的作用；如：辣椒素通過誘導細胞周期G0/G1停滯和細胞凋亡對人結腸癌細胞具有抗增殖作用，而且辣椒素抗腫瘤效能與p53的穩定和活化有關[27]；辣椒素可以抑制AGS人胃癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡和自噬[28]；辣椒素可以介導人膀胱癌細胞凋亡，而且通過CD91激活樹突細胞從而獲得有效和持久的抗癌T細胞介導的免疫作用[29]；辣椒素對SUM149PT乳腺癌細胞有抗腫瘤活性[30]。這種辣椒素對細胞凋亡作用的不同可能與細胞類型、細胞損傷程度、辣椒素濃度等有關。

TRPV1又稱辣椒素受體，在1997年由Caterina等人第一次從大鼠背根神經節和三叉細胞中克隆出來，是一種配體門控的陽離子通道，辣椒素是TRPV1的天然配體[31]；辣椒平是辣椒素的競爭性拮抗劑[32]。另外，TRPV1受體在器官缺血再灌注損傷中起著重要作用[33]。本課題組在以前的研究發現，缺血前給予辣椒素顯著改善了大鼠心臟缺血再灌注后大鼠心臟功能和減少了心肌梗死面積，其機制可能與激活辣椒素受體, 引起P物質釋放，進一步激活NK1型P物質受體有關；在辣椒素前給予辣椒平消除了辣椒素的心臟保護作用[5]。缺血前給予辣椒素降低了大鼠的肺缺血再灌注誘導的肺部炎癥和氧化應激，減弱了肺功能障礙，其機制可能是通過激活TRPV1受體和釋放降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)；而在辣椒平預處理組其保護作用消失[8]。這些研究表明，辣椒素是通過作用于TRPV1而減輕肺缺血再灌注損傷。既往研究表明，TRPV1不僅表達在感覺傳入神經元以及神經末梢，而且在血管內皮細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞等非神經細胞上也有表達[34-35]，TRPV1在呼吸道也表達，包括鼻粘膜細胞、C纖維神經元、氣道平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞[36]。因此，我們推測辣椒素可能是通過作用于細胞上的TRPV1受體而發揮抗凋亡作用，其具體機制有待進一步的研究。

4 結論

缺氧前給予一定濃度的辣椒素可促進缺氧復氧A549細胞增殖，并抑制其凋亡，對缺氧復氧細胞有保護作用，但是高濃度(2500μM)辣椒素可抑制缺氧復氧A549細胞增殖活力，對缺氧復氧細胞有損傷作用。

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