老年癡呆模型中人參皂苷Rg1預處理對大鼠腦片中突觸素表達的影響*

李明 李璽 權乾坤 袁海峰 徐陽

(1.西安交通大學第二附屬醫院, 陜西 西安 710004；2. 西安市第五醫院, 陜西 西安 710083)

老年性癡呆是一種常見于老年人的神經退行性變性疾病。有研究表明，老年大鼠海馬突觸數量和突觸素(Synaptophysin,SYN)表達明顯減少[1]，在老年癡呆患者早期即可出現突觸的喪失，其認知障礙程度與突觸結構和功能的改變密切相關。因此，突觸的病理性重構是老年性癡呆認識障礙的重要病理基礎[2-4]。研究表明，老年大鼠腦內突觸素丟失程度與記憶缺失程度呈正相關[5]。

人參皂甙Rg1是人參“益智延年”的主要成分, 其主要的靶器官是中樞神經系統。近年來，人參皂苷Rg1對神經保護、增強記憶和抗衰老作用方面的研究已取得了一定進展[6]，已成為研究中藥抗癡呆的熱點之一。研究發現，人參皂甙Rg1對多種實驗動物模型的學習記憶障礙均有明顯的改善作用，其作用機制可能與提高膽堿能功能，促進M-膽堿受體數量明顯增加、促進受體蛋白合成有關[7]。人參皂甙Rg1還有抗氧化，清除自由基，抗衰老和抑制細胞凋亡的作用[8-10]。但是目前關于人參皂甙Rg1對SYN表達是否有上調作用并不清楚。因此,本實驗采用岡田酸(okadaic acid，OA)制備老年癡呆大鼠腦片模型，觀察人參皂苷Rg1對老年癡呆模型大鼠腦片中SYN表達的影響，旨在闡明人參皂苷Rg1能否通過影響突觸素的活性表達，發揮抗老年性癡呆神經退行性變的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇體重110～130g雄性 SD大鼠,5周齡，清潔級，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(陜)2007-001。實驗中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導意見》。

1.1.2 主要儀器 光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司產品，型號：BH22；冰凍切片機，德國MICROM公司產品，型號：HM500；振動切片機，上海之信儀器有限公司產品，型號：ZQP-86；圖像處理與分析系統，德國LEICA公司產品，型號：Qwin550CW。

1.1.3藥物與試劑 人參皂苷Rg1購自吉林宏久生物科技股份有限公司，分子式為C42H72O14,化學結構式見圖1，純度98.99%，使用前溶于分析純甲醇。OA購自美國ALEXIS生物制劑公司，純度98%，使用前溶于10% 二甲基亞砜(dimethy sulphoxide, DMSO)，配制成1 mg/mL二甲亞砜溶液待用。SYN蛋白兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒(SABC)及DAB均為北京博奧森生物技術有限公司產品。Haws’S蘇木素由西安交通大學醫學實驗中心提供。

圖1 人參皂苷Rg1分子結構示意圖Figure 1 The chemical structural formula of Gensenoside Rg1

1.2 方法

1.2.1 腦片制備 配置人工腦脊液(成分：mmol·L-1)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 KH2PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) ，取5周齡SD大鼠，參照文獻方法[11]，大鼠經6%水合氯醛麻醉后，斷頭取腦，快速置于0～4 ℃的人工腦脊液冰水混合物中，振動切片機以振幅8檔，速度3檔行冠狀切片所切腦片含皮層和海馬，平均厚度400μm。挑選形態較好(含海馬和皮層)的腦片置入盛有人工腦脊液的6孔板中培養，溫度(32.0±0.5)℃，整個過程人工腦脊液中持續通入混合氧氣(95%O2+5%CO2)。

1.2.2 分組及干預 腦片隨機分為5組：空白組、模型組、人參皂苷Rg1低、中、高濃度組，每組10張腦片。人工腦脊液孵育1小時，人參皂苷Rg1各組分別加入人參皂苷Rg1(60 μmol·L-1、120 μmol·L-1、240 μmol·L-1)培養2 h，模型組和人參皂苷Rg1各濃度組分別加入OA(1 μmol·L-1)培養3 h后，固定處理。

1.2.3 腦片SYN表達檢測 標本經4%多聚甲醛固定4 h，取出，轉入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰凍切片，切片10μm厚，每張切片含皮層、海馬、齒狀回。然后進行免疫組織化學染色，組織切片經抗原修復, 3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min, 兔抗大鼠SYN濃度為1:600, 4℃過夜,生物素標記的單克隆小鼠抗兔IgG即用型二抗和SABC試劑各在室溫下作用30 min, 鏈酶親和素-過氧化物酶復合物進行抗原修復，最后DAB顯色,蘇木素輕度復染, PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.4 圖象分析 采用圖象處理與分析系統，檢測陽性反應物質的平均灰度值，每張切片同一區域中，隨機選取6個視野，檢測面積相同，取其平均值作為該切片目標區域的平均灰度值。灰度值越低，蛋白表達量越高，反之灰度值越高，蛋白表達量越低。

2 結果

SYN的陽性免疫反應物質為棕黃色，主要分布于細胞的突觸、胞膜和胞漿，胞核不著色或著色淡。本實驗中，大鼠腦片經岡田酸孵育后，模型組與空白組比較，SYN的陽性細胞表達量明顯減少(P<0.05)。經人參皂苷Rg1干預后檢測腦片SYN的陽性細胞表達變化發現，與模型組比較，各濃度藥物組SYN的陽性細胞表達量均有增加(P<0.05)，其中低劑量組與中劑量組在CA1和Cortex之間比較差異有統計學意義(P<0.05)，同時在各腦區人參皂甙Rg1高劑量組SYN的陽性細胞表達明顯優于人參皂甙Rg1中、低劑量組，存在一定的劑量依賴關系，見表1、圖2。

表1 人參皂甙Rg1對老年癡呆模型大鼠腦片SYN的影響(灰度值)Table 1 Expression of SYN protein in rat brain slices in different groups

注：與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與高劑量組間比較，③P<0.05；與中劑量組比較，④P<0.05

圖2 免疫組織化學法檢測各組大鼠腦片皮層區SYN蛋白陽性細胞表達(光學顯微鏡，×400)Figure 2 Expression of SYN protein in cortex in different groups observed by immunohistochemical method注：A. 空白組； B. 模型組； C. 人參皂甙Rg1高濃度組

3 討論

突觸素是突觸小泡中含量最多的特異性膜通道蛋白，在所有的神經末梢內幾乎都有分布,是神經元和神經內分泌細胞的一種特異性標記物。它在突觸囊泡的導入、轉運、再循環和神經遞質的釋放及突觸的發生和發育，以及突觸的可塑性中都具有非常重要的作用，是學習記憶過程中的重要蛋白[12-13]。突觸素分布數量和密度可間接反映突觸的數量和密度[14]。突觸喪失將會引起嚴重的認知障礙,學習記憶功能受損[15]。因此，免疫組化圖像采集及數據分析能反映神經元突觸變化狀況。本實驗將岡田酸加入培養大鼠腦片的ACSF中結果發現,與空白組比較,模型組SYN蛋白陽性表達細胞量下降(P<0.05) ,推測可能是岡田酸造成大鼠腦片神經元變性壞死,導致軸突終末變性、丟失，突觸數量及突觸素表達的降低，這與文獻報道一致[16]。

人參皂苷 Rg1 作為人參促智作用的主要有效成份之一，對 AD 具有多種神經保護作用[17-21]。目前還未有研究證實人參皂苷 Rg1 是否可以通過上調腦內SYN表達在突觸的可塑性中起一定的作用。本實驗在ACSF中首先加入人參皂苷Rg1預處理2 h,然后再加入岡田酸,結果發現,人參皂苷Rg1各組腦片SYN蛋白的陽性細胞表達較模型組顯著提高(P<0.05)。這說明人參皂苷Rg1可能通過對抗岡田酸對SYN的抑制作用, 上調SYN的蛋白表達水平，且表達隨劑量的增加而增加,人參皂苷Rg1藥效作用呈一定的劑量依賴關系。

總之，人參皂苷 Rg1對OA所致AD大鼠腦片有明顯的干預作用,這種作用可能與人參皂苷 Rg1提高腦片突觸素的陽性表達、增加神經元保護有關，具體機制還有待進一步探討。

4 結論

本文結果顯示，以OA誘導大鼠腦片tau蛋白發生磷酸化，制備AD樣tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型，經人參皂苷Rg1預處理后，SYN的陽性細胞表達明顯增加且呈劑量依賴關系。由此可見，人參皂苷Rg1通過上調腦內SYN的表達，增加神經元保護，以此發揮抗癡呆作用。

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