液相色譜-串聯質譜法測定肉品中氯噻啉藥物殘留

周大衛

（北京市食品及釀酒產品質量監督檢驗一站，北京 100075）

氯噻啉是一種新煙堿類殺蟲劑，是繼有機磷、有機氯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑之后的新型農藥，其分子結構式如圖1所示。氯噻啉屬于廣譜殺蟲劑，對鞘翅目、雙翅目和鱗翅目害蟲均有很好的防治效果，尤其對葉蟬、稻飛虱、薊馬和水稻螟蟲具有比較高的毒力，且因其價格低廉，使得越來越多的種植人員使用氯噻啉替代原有農藥來防治蟲害[1-4]。然而，由于我國部分種植人員在農藥施放環節操作不科學，往往造成農作物中的農藥殘留超標。畜禽位于食物鏈的下游，攝食玉米、豆粕、糠、麥麩等農作物的產品或副產品，超量殘留的農藥會積累在家畜體內，最終危害人體健康[5-7]。

圖1 氯噻啉分子結構式Fig. 1 Molecular formula of imidaclothiz

氯噻啉的毒理學數據為雌性小鼠口服半致死量LD50=90 mg/kg，雄性小鼠口服半致死量LD50=126 mg/kg，屬中等毒性，對豚鼠皮膚變態反應（過敏）的實驗結果為弱致敏性，大鼠喂飼原藥最大無作用劑量為1.5 mg/kg，若以100 倍安全系數計，則人體每日允許攝入量為0.015 mg/kg[8]。

GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中農藥殘留最大限量》[9]中規定，氯噻啉的最大允許殘留量在稻谷中為0.1 mg/kg，在小麥中為0.2 mg/kg。由于氯噻啉是一種新型農藥，所以我國還沒有相應的檢測標準。目前，關于氯噻啉檢測方法的研究主要包括液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[10-12]、LC法[13-15]、氣相色譜（gas chromatography，GC）-MS法[16]、膠體金免疫層析法[17]和毛細管電泳法[18]。在已有的報道中，研究對象只有水果、蔬菜、茶葉、大米等植物源性樣品，未見到有關生鮮肉中氯噻啉殘留檢測方法的報道，而植物源性樣品的前處理方法并不適用于蛋白質和脂肪含量較高的生鮮肉樣品。

動物源性樣品中農藥殘留檢測的前處理方法一般有固相萃取法和QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safty）法。與QuEChERS法相比，固相萃取法的處理步驟較為繁瑣，需要多次濃縮，耗時長、易損失、回收率低[19-21]，故本研究采用QuEChERS法進行樣品提取，采用LC-MS/MS法定量檢測肉品中的氯噻啉殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯噻啉標準品（純度≥96%） 德國Dr.Ehernstorfer公司；乙腈、甲酸（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；氯化鈉、無水硫酸鈉及無水硫酸鎂（均為分析純）北京化工廠；N-丙基乙二胺（primery secondary amine，PSA）吸附劑（40～63 μm）、C18吸附劑（40～63 μm） 上海安譜科學儀器有限公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、豬肝、豬腎、羊肝、羊腎樣品各10 kg，均采購于北京市內超市。

1.2 儀器與設備

LC-20ADXR液相色譜儀 日本Shimadzu公司；API3200三重四極桿LC-MS/MS儀 美國AB Sciex公司；BP110S分析天平（感量0.1 mg） 瑞士Sartorius公司；MS1602TS分析天平（感量0.01 g） 瑞士Mettler Toledo公司；TGL-16M高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；T18高速均質機、MS3漩渦振蕩儀德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液的配制：準確稱取氯噻啉標準品10.0 mg于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成質量濃度為100 μg/mL的標準儲備液，4 ℃冷藏保存，有效期為6 個月。

1.3.2 樣品制備

將樣品用均質機勻漿后，準確稱取2.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈、適量甲酸和無機鹽提取劑。擰緊離心管蓋后漩渦振蕩提取1 min，在10 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min。取5 mL上層有機相，轉移至裝有50 mg PSA吸附劑和150 mg C18吸附劑的15 mL離心管中；擰緊離心管蓋后漩渦振蕩1 min，在10 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min。吸取2 mL上清液，加入2 mL水，振搖，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后供LC-MS/MS測定。

其中，分別選擇甲酸添加量為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mL，根據樣品中氯噻啉的回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），確定甲酸的最佳添加量。

無機鹽提取劑的選擇：向樣品中加入氯噻啉標準物質，使其添加量為20.0 μg/kg，再分別加入乙腈及不同比例的無機鹽，并加入甲酸調整pH值為2.70，進行提取、凈化后定容，上機測定后計算回收率。根據樣品中氯噻啉的回收率和RSD，確定無機鹽提取劑的最佳組合。

1.3.3 LC條件

Waters BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序為：0～1.0 min，流動相A 5%；1.0～4.0 min，流動相A 5%～95%；4.0～5.0 min，流動相A 95%；5.0～5.1 min，流動相A 95%～5%；5.1～8.0 min，流動相A 5%；柱溫35 ℃；流速0.30 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.4 MS條件

采用電噴霧離子源正離子模式（electron spray ionization in the positive mode，ESI＋），多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度550 ℃，電噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力0.050 MPa，輔助加熱氣壓力0.050 MPa，氣簾氣壓力0.015 MPa，霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣、碰撞氣均為氮氣。

1.3.5 方法準確度和精密度測定

稱取豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、豬肝、豬腎、羊肝及羊腎樣品，每種樣品5 份，每份2.00 g。向每種樣品的5 份試樣中分別加入40、100、200、400、1 000 μL質量濃度為10 ng/mL的氯噻啉標準溶液，即其在樣品中的添加量為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg。采用優化后的方法進行處理，用LC-MS/MS儀測定。每個樣品均進行8 次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

2.1.1 無機鹽提取劑的選擇

氯噻啉有N-硝基胍結構，具有熱不穩定性。傳統的QuEChERS方法，提取時為使目標化合物在水相中飽和后能更充分地分布于有機相中，會加入無水硫酸鎂[22-26]，而無水硫酸鎂與樣品中的水分接觸后會大量放熱，導致氯噻啉在提取時遇熱分解產生損失。

參照AOAC 2007.01《利用乙腈提取和硫酸鎂分離測定食品中農藥殘留的分析方法：氣相色譜-質譜法和液相色譜-串聯質譜法》[27]中的凈化方法和其他學者檢測動物源性食品中獸藥殘留的前處理方法[28]及檢測植物源性食品中農藥殘留時的提取凈化方法[29-30]，對本研究的前處理條件進行優化。研究加入不同比例的無機鹽提取劑對目標化合物提取效果的影響，最終確定一種最優前處理方案。

表1 不同比例無機鹽提取劑對目標化合物提取回收率的影響（n=8）Table 1 Effects of inorganic salt extractants on the extraction of target compound (n= 8)

由表1可知：對于第1組樣品，不加入無機鹽時，則氯噻啉大部分溶于樣品中所帶的水分中，沒有完全被乙腈提取出來，回收率只有44.81%；對于第2組樣品，提取時只加入氯化鈉，則氯噻啉在提取時依然不能充分被分配至有機相，其回收率只有69.75%；對于第3組和第4組樣品，只加入無水硫酸鎂或無水硫酸鈉時，氯噻啉的回收率相較于第2組樣品分別提高了4.62%和11.07%，但依然偏低；對于第5組樣品，同時加入氯化鈉和無水硫酸鎂時，氯噻啉的回收率相較于第2組樣品提高了15.71%，但由于無水硫酸鎂的放熱作用，導致一部分氯噻啉產生了損失；對于第6～9組樣品，降低了無水硫酸鎂的添加量，同時提高了無水硫酸鈉的添加量，此過程中氯噻啉的回收率逐漸提高至92.08%；對于第10～15組樣品，實驗結果表明，在加入無水硫酸鎂或無水硫酸鈉后，單純增加氯化鈉的含量已經不能再提高氯噻啉的回收率。結合上述實驗結果，并出于對節約試劑的考慮，本研究最終確定無機鹽提取劑為1.00 g氯化鈉和4.00 g無水硫酸鈉。

2.1.2 提取pH值的選擇

氯噻啉在酸性條件下穩定，而在堿性條件下易分解，因此在提取時控制pH值是保證回收率良好的關鍵。

表2 不同甲酸添加量對目標化合物提取回收率的影響（n=8）Table 2 Effect of formic acid on the extraction of target compound (n= 8)

由表2可知：對于第1組樣品，由于氯噻啉分子上的—NO2結構是強吸電子基團，使得與之相鄰的C＝N基團上的C原子具有強烈的吸附電荷趨勢，當提取溶劑中未加入甲酸時，該C原子易受到溶液中—OH的進攻，從而發生親核取代反應，導致氯噻啉分子分解，因此氯噻啉的回收率只有66.75%；對于第2～6組樣品，隨著甲酸添加量的增加，pH值逐漸下降，提取過程中氯噻啉的分解率逐漸降低，回收率也逐漸提升，當甲酸添加量為0.10 mL時（溶液pH值為2.70），氯噻啉的回收率為93.67%；對于第7～8組樣品，繼續增加甲酸的添加量，氯噻啉的回收率不再提高。故本研究選擇在提取溶劑中加入0.10 mL甲酸（溶液pH值為2.70）。

2.1.3 MS條件的優化

首先采用1 μg/mL氯噻啉標準溶液為樣品，以流動注射方式，在ESI＋模式下進行全掃描，確定母離子；然后打開碰撞室能量，使用二級MS掃描，確定子離子；進一步優化去簇電壓、碰撞電壓等參數。氯噻啉的特征離子質量色譜圖如圖2所示，氯噻啉的去簇電壓、碰撞電壓及其他MS參數如表3所示。

圖2 氯噻啉的特征離子質譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of characteristic fragment ions for imidaclothiz

表3 氯噻啉的MS參數Table 3 Mass spectrometric parameters of imidaclothiz

2.2 方法準確度和精密度

表4 不同基質中氯噻啉的回收率及精密度測定結果（n=8）Table 4 Recoveries and precision of imidaclothiz in different matrices (n= 8)

依據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[31]附錄F中檢測方法確認的技術要求，回收率在90%～110%時的最低添加濃度為方法檢出限。由表4可知，不同基質中氯噻啉的方法檢出限均為5.0 μg/kg，對應的RSD在2.4%～3.2%之間。

2.3 基質效應對檢測結果的影響

基質效應是指在樣品測試過程中，由于待測物以外物質的存在直接或間接影響待測物響應的現象[32]。生鮮肉樣品即使經過凈化處理也會含有大量糖類、胺類、肽類等有機化合物，在LC-MS/MS技術中，這些非揮發性基質組分在通過ESI源時，會將帶電液滴吸附在一起，阻止其分裂成更小的霧滴，進而阻礙氯噻啉的離子化過程，降低氯噻啉在質量分析器上的響應值。

外標法制作校正曲線的過程是用乙腈稀釋氯噻啉標準品后，直接用LC-MS/MS儀測定，由于測定液中沒有抑制離子化的基質，因此響應值會比同等濃度的帶有基質的樣品測定液更高一些。

圖3 豬肉基質中氯噻啉（10 ng/mL）的質譜圖Fig. 3 Mass chromatogram for imidaclothiz (10 ng/mL) in pork matrix

圖4 用乙腈稀釋的氯噻啉（10 ng/mL）的質譜圖Fig. 4 Mass chromatogram for imidaclothiz (10 ng/mL) diluted in acetonitrile

由圖3～4可知，采用外標法檢測生鮮肉樣品中的氯噻啉不能準確地得到氯噻啉在樣品中的真實含量。

表5 不同基質校正曲線的回歸方程Table 5 Calibration curve equations for different matrices

不同基質中含有的抑制離子化的組分不同，其抑制率不同，在LC-MS/MS儀上的響應就會不同，不同基質的基質添加校正曲線的斜率與截距就會不同。本研究采用基質添加曲線測定肉品中的氯噻啉含量。由表5可知，檢測不同基質中的氯噻啉要選取相對應的陰性基質來繪制基質添加曲線，避免基質效應帶來的定量差異。不同基質的校正曲線在10～400 ng/mL范圍內的相關系數均大于0.995，因此該方法校正曲線的線性關系良好。

3 結 論

本研究建立了氯噻啉的LC-MS/MS檢測方法，方法檢出限為5.0 μg/kg，在不同肉品基質中的回收率為91.41%～93.51%，RSD在2.4%～3.2%之間。本方法操作簡便、分析速度快、靈敏度高、重現性好，可以用于肉品中氯噻啉殘留的檢測，為肉品中氯噻啉的檢測提供了有力工具，對保證我國肉品的安全衛生具有十分重要的意義。

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