雙芳基酮還原酶的基因挖掘及催化性質

唐銘燴 ， 許國超 ， 倪 曄 *

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

（R）-（4’-氯苯基）-（吡啶-2’-基）-甲醇[（R）-（4’-chlorophenyl） （pyridin-2’-yl）methanol， （R）-CPMA，C12H10ClNO]是一類重要的手性雙芳基甲醇，可作為關鍵手性中間體用于合成治療梅尼埃綜合癥、血管性頭痛、腦動脈硬化及急性缺血性腦血管等疾病的藥物，如抗組胺藥倍他司汀。鑒于手性（R）-CPMA和雙芳基甲醇廣泛的應用價值，其高效、綠色地合成具有非常重要的意義。目前手性雙芳基甲醇的合成方法主要有對映選擇性拆分法、親和加成法和生物不對稱還原法，而由于生物不對稱還原法具有100%的理論得率、操作簡便、反應條件溫和等特點被認為是最具應用潛力的合成方法之一[1-3]。

Corey EJ 等[4]發現 CBS（Corey-Bakshi-Shibata）還原劑可用于雙芳基甲酮底物的不對稱還原，生成手性雙芳基甲醇，該法是目前為止具有最高對映選擇性的化學還原法。在-40℃條件下，手性硼雜惡唑烷（CBS催化劑）和兒茶酚硼烷的甲苯溶液可還原1-（4’-氯苯基）-（吡啶-2’-基）-甲酮（CPMK）生成（R）-CPMA，最終反應轉化率為78%，ee值為98%。但該方法的反應溫度條件苛刻，對底物的要求高，才會具有高選擇性，因此適用范圍非常有限[1]。2007年，Truppo MD等篩選了一系列商品化酮還原酶KRED后，發現雖然有一些KRED對雙芳基酮底物有還原能力，但立體選擇性一般，僅KRED124可以不對稱還原10 g/L的CPMK生成（R）-CPMA，ee值為94%，轉化率98%[5]；2009年，Zhu DM等發現來源于Sporobolomyces salmonicolor的重組羰基還原酶SSCR及其突變體可以立體選擇性還原不同雙芳基酮底物 （8-99%ee）[6-7]，在葡萄糖脫氫酶的協助下，可還原 1-（4’-氯苯基）-1-苯基甲酮生成 1-（4’-氯苯基）-1-苯基甲醇，轉化率為62%，對映選擇性為 88%（R）；2012年，本研究室周婕妤等[8-9]通過傳統富集培養篩選到一株克魯維酵母Kluyveromycessp.CCTCCM2011385，可催化還原 CPMK 生成（S）-CPMA（87%ee），然而野生菌全細胞最高僅能催化2 g/L CPMK的轉化反應。

作者采用基因組數據挖掘的策略，克隆了9個不同來源的假定雙芳基酮還原酶。經功能篩選發現來源于克魯維多孢酵母Kluyveromyces polysporus的羰基還原酶KpADH對CPMK具有最高的催化活性和對映選擇性，且該酶可用異丙醇為輔底物實現自身底物偶聯型輔因子循環。為了更好的應用KpADH，作者對重組KpADH進行純化，研究了該酶的最適溫度、最適pH、金屬離子依賴性、有機溶劑耐受性、底物特異性和酶動力學參數等酶學性質，并考察了重組菌在生物催化CPMK不對稱還原上的效果，對進一步利用雙芳基酮還原酶KpADH合成手性雙芳基仲醇具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 本研究所用到的菌株和質粒見表1。

表1 本研究所用到的菌株及載體Table 1 Lists of microorganism strains and vectors used in the study

1.1.2 引物 本研究用到的引物見表2。

1.1.3 培養基 LB培養基（g/L）：酵母提取物5；胰蛋白胨10，氯化鈉10；pH 7.0，121℃滅菌20 min。固體培養基則添加2 g/dL的瓊脂。

表2 基因挖掘實驗所用引物Table 2 Primers used in genome mining.

1.1.4 試劑 T4 DNA連接酶、限制性內切酶NdeI、BamH I、prime star DNA 聚 合 酶 、protein molecular marker：購于大連寶生物；2×Taq DNA 聚合酶：購于杭州寶賽生物工程有限公司；DNA marker、質粒及基因組提取試劑盒、膠回收及PCR產物純化試劑盒：購于上海捷瑞生物工程有限公司；NADPH及NADP+：購于Roche；發酵培養基各種成分：購自國藥集團藥業股份有限公司；IPTG、卡那霉素：購于生工生物（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因序列的擴增 按照酵母及細菌基因組DNA抽取試劑盒（上海生工生物有限公司）說明書提取各菌株的基因組，并以此為模板，添加表1所示引物進行PCR擴增，反應體系為：dNTP mix 4 μL，5× prime star buffer 10 μL，引物 1（10 μmol/L）1 μL， 引物 2 （10 μmol/L） 1 μL， 模板 10～50 ng，DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 補足到 50 μL。 PCR的擴增程序為：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min 10 s，循環25次，72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.2 重組質粒的構建與大腸桿菌基因工程菌的構建 目的基因與表達載體pET-28a同時進行雙酶切。酶切體系為：目的基因/質粒1 000 ng，10×K buffer 10 μL，Nde I（10 U/L） 2 μL，BamHI（10 U/L）2 μL，ddH2O 補足到 100 μL。 將上述反應液混合均勻，于37°C酶切完全。參照核酸膠回收試劑盒說明書回收酶切后的目的基因和pET28a，然后用T4連接酶連接，連接體系為：T4連接酶 （5 U/L）1 μL，10×Ligation buffer 1 μL，線性化 pET28a 50 ng，目的基因 100 ng，ddH2O補足到20 μL。反應液混合均勻，16℃連接10 h。將連接產物轉入感受態E.coli BL21（DE3）中，將后培養液均勻涂布于含有卡那霉素的固體平板上，于37℃倒置培養12 h，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，選擇陽性克隆進行培養及測序驗證。

1.2.3 培養條件、粗酶液的制備、蛋白質純化及酶活測定 將上述菌種接種至30 mL培養基中，于37℃，180 r/min振蕩培養，待OD600達0.6時加入30 μL IPTG誘導（IPTG濃度為100 mmol/L），于 30℃繼續振蕩培養5 h。在4℃和8 000 g條件下離心5 min，倒掉上清液，向菌體中加入10 mL的磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0），使用超聲波破碎儀破碎細胞（功率 285 W，工作 1 s，間歇 3 s，10 min）。 取其中1 mL進行12 000 r/min離心5 min，取上清液（粗酶液）進行酶活測定。重組KpADH蛋白的純化方法參見前期報道[10-11]。

還原活力測定方法：總反應體系為200μL，包括 0.5 mmol/L NAD（P）H，0.5 mmol/L CPMK，磷酸鉀緩沖液（KPB，100 mmol/L，pH 5.5），充分混勻，30 ℃保溫2 min，加入10 μL合適濃度的酶液，檢測340 nm下吸收值的變化。酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化 1 μmol NAD（P）H 所需要的酶量。

氧化活力測定方法：總反應體系為200μL，包括 5 mmol/L NAD（P）+，10 mmol/L 異丙醇，磷酸鉀緩沖液（KPB，100 mmol/L，pH 10.0），充分混勻，30 ℃保溫2 min，加入10 μL合適濃度的酶液，檢測340 nm下吸收值的變化。酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化還原 1 μmol NAD（P）+所需要的酶量。

其中，EW為1 min內340 nm處吸光值的變化；V為反應液的總體積 （mL）；6 220為摩爾消光系數（L／（mol·cm））；l為光程距離（cm）。

蛋白質含量測定采用Bradford法，以小牛血清白蛋白BSA為標準品[12]。

酶比活力計算公式：

1.2.4 全細胞水相催化及檢測 將30 mL誘導后的重組菌E.coli BL21/pET28a-kpadh（OD600約為5），充分重懸于 9.5 mL磷酸鈉緩沖液 PBS（100 mmol/L，pH 8.0），于 20 mL的反應器中加入 100 mmol/L 的 NADP+10 μL，500 mmol/L 的 CPMK （溶解于異丙醇）500 μL，總體系為10 mL。將上述反應體系置于30℃，180 r/min振蕩反應直至反應結束。每隔一段時間取樣 100 μL， 加入 400 μL PBS（100 mmol/L，pH 8.0）緩沖液和 500 μL 乙酸乙酯萃取，取出上層有機相，待有機相自然揮發完全，加入500 μL HPLC級的乙醇，進行正相HPLC檢測。

通過正相HPLC分析CPMK轉化率和 （R）-CPMA的對映選擇性，具體方法為：Agilent 1100 HPLC（美國），Chiralcel OB-H（0.46 mm×250 mm×5 μm）色譜柱，流動相為含有0.1%乙醇胺的正己烷∶乙醇（體積比 95∶5），流速 1.0 mL/min，254 nm，柱溫30 ℃，（S）-和 （R）-CPMA 的保留時間分別為 8.2、9.0 min。ee值計算公式：

式中，AR為（R）-CPMA 的峰面積；AS為（S）-CPMA的峰面積。

2 結果與討論

2.1 基因挖掘、重組菌株的構建及篩選

來源于近平滑假絲酵母 （Candida parapsilosis）的醇脫氫酶CpSADH，具有廣泛的底物譜，可以催化多種潛手性羰基化合物的不對稱還原，可還原76.6 g/L 的 1，3-丁二酮為（R）-1，3 丁二醇（95%ee）[13-14]，對苯乙酮、丁酮和酮酯等底物也有很高的還原活力，因此我們推測其底物結構口袋較大，可以容納雙芳基酮類底物。更重要的是CpSADH具有底物偶聯輔因子再生的活性，可利用異丙醇為輔底物實現NADPH的原位再生[14]。具備底物偶聯的輔因子再生的羰基還原酶可單獨實現不對稱還原反應的進行和輔因子再生，無需外源輔因子再生系統如葡萄糖脫氫酶等的協助，避免了雙酶的比例不匹配等不足，降低催化劑的制備成本，受到生物還原法的青睞。在酶的基因挖掘中，序列相似性在30%～70%的基因通常既保留了一部分與探針酶相似的功能，又具有一定的特異性。因此本研究選用CpSADH作為基因挖掘的探針酶，將其蛋白質序列在NCBI數據庫中比對后選取9個未經報道且與探針序列相似性為34%～65%的基因進行表達和篩選，見表3。

按照方法1.2.1和1.2.2成功將9個基因從基因組上進行擴增，并連接到表達載體pET28a，將重組載體熱轉入E.coli BL21（DE3），成功構建重組菌。按照方法1.2.3對重組菌進行搖瓶培養，誘導產酶，并結合SDS-PAGE分析和酶活力分析對假定羰基還原酶進行功能篩選。僅有來源于K.polysporus的CR1可以檢測到對CPMK有明顯的還原活力（1.4 U/mg），并且CR1還可氧化異丙醇 （0.40 U/mg）。因此CR1是一個具有底物偶聯輔因子再生能力的雙芳基酮還原酶，并將其命名為KpADH，其編碼基因為kpadh。為了進一步拓展其在手性雙芳基醇合成中的應用，作者對其進行分離純化，研究了KpADH的酶學性質及不對稱還原反應效果。

2.2 KpADH的蛋白質序列分析

羰基還原酶的分類有很多，按催化功能及空間結構的差異可以分為3大類：醛還原酶（AKR）、短鏈脫氫酶（SDR）及中鏈醇脫氫酶[15]。SDR是氧化還原酶中具有多樣性功能的一類酶，其蛋白質結構中一般包含保守N端、參與NAD（P）（H）識別和結合的Rossmann折疊、底物結合結構域和非保守的C端。Extended SDR和Classical SDR是SDRs家族中最重要的兩個亞家族，Extended SDRs家族的酶有共同的輔因子結合區域及結合序列，即位于N端的[S/T]GXXGXX[G/A]（X代表任意的一種氨基酸）序列，除此之外還有保守的催化基序YXXXK。將KpADH的氨基酸序列在NCBI數據庫中比對顯示，KpADH屬于Extended SDR亞家族。從數據庫中選取了KpADH的同源酶，并進行多序列比對，結果見圖1。可以看出，KpADH雖然與這些酶在一級序列上具有一定的差異性，但二級結構很保守，且具有保守的輔因子識別區和催化三聯體，如Ser126，Tyr165和Lys169（紅色三角形標識）。綜上，KpADH與已知醇脫氫酶CpSADH的序列一致性僅為38%，且未曾有關于該酶催化功能的研究報道，該酶屬于短鏈脫氫酶家族的新成員。

表3 基因數據挖掘中所選取的假定羰基還原酶Table 3 Putative carbonyl reductases selected from NCBI database using genome mining

圖1 KpADH與來源于Extended SDRs家族蛋白質的氨基酸序列比對Fig.1 Sequence alignment of KpADH to other carbonyl reductase sequences

2.3 KpADH的純化

為了研究KpADH的酶學性質，對重組KpADH依次進行鎳柱純化、脫鹽和濃縮處理，最終得到0.5 mg/mL的純酶。對粗酶、穿透峰蛋白和純酶進行SDS-PAGE分析，見圖2。KpADH純酶僅有一條帶，純酶純度達到電泳純，活力回收率約為45.5%。根據SDS-PAGE圖計算可知，KpADH單亞基的相對分子質量約為45 000，與理論相對分子質量大小相符。純酶的比還原活力8.9 U/mg，粗酶的比還原活力為1.4 U/mg，純化倍數為6倍。輔因子依賴性測定顯示，KpADH既可以依賴于NADPH也可依賴于NADH，且在NADPH存在下KpADH的活力約為NADH的5倍。

圖2 純化KpADH的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified KpADH

2.4 KpADH的動力學參數的測定

Km是酶的一個特征性常數，Km的大小只與酶的性質有關，Km越小親和力越大，kcat越大催化效率越高，為了研究該酶對底物的親和力和催化效率，作者測定KpADH在不同底物濃度和輔酶濃度情況下的酶活，并得到了很好的線性擬合，見圖3。計算得到KpADH的動力學參數，見表4。

由表4可知，該酶對CPMK的親和力（Km=0.50 mmol/L）高于對異丙醇的親和力（Km=6.36 mmol/L），且還原CPMK的速率（kcat=64.67 s-1）高于氧化異丙醇的速率（kcat=55.27 s-1），因此KpADH對CPMK的底物專一性常數 kcat/Km（129.33 L/（s·mmol））高于異丙醇（8.69 L/（s·mmol））。 由此可知該酶更傾向于發揮還原CPMK的功能，有利于還原反應朝 （R）-CPMA合成的方向進行。該酶對輔酶NADPH的kcat，kcat/Km均高于NADP+，說明該酶更傾向于氧化NADPH，這也符合該酶傾向于還原CPMK的結果。

圖3 KpADH的動力學參數Fig.3 Kinetic parameters of KpADH

表4 KpADH的動力學參數Table 4 Kinetic parameters of purified KpADH

2.5 pH對KpADH催化活性的影響

緩沖液的pH會通過改變活性中心的微環境來影響酶的催化活性，本研究測定在不同的pH緩沖液中（檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0～6.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）、 甘氨酸-NaOH 緩沖液 （pH 8.0～12.0））KpADH的氧化和還原活力的高低，結果見圖4。對于KpADH的還原活力，其最適pH 5.5，當pH＜5.5時活力迅速下降，當pH＞5.5時下降緩慢，且在堿性范圍內KpADH仍保留有一定的催化活力，如在pH 8.0時，相對活力約為58%。對于KpADH的氧化活力，其最適pH為9.5，當pH＜9.5時，活力迅速下降，在酸性范圍內僅保留有約40%的催化活力，在pH 9.5～11.0時，KpADH的相對氧化活力＞80%。此外，在氧化反應的最適pH下，還原活力僅27%，而在還原反應的最適pH下，氧化活力僅5%。為了利用該酶的底物偶聯輔因子再生的優勢，需要同時具備較高的氧化和還原活力，才能實現輔因子原位再生和底物還原的目標。因此在生物催化過程中，需要對反應緩沖液的pH值進行優化，選擇氧化和還原活力均較高的pH，以使得催化劑發揮最大的作用。

圖4 pH對KpADH酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of purified KpADH

2.6 金屬離子及添加劑對KpADH活力的影響

據報道，少數SDR家族的羰基還原酶具有金屬離子依賴性，如二價金屬離子Mg2+可通過作用于酶的活性中心或底物結合位點而影響酶的活力。作者考察了不同金屬離子對羰基還原酶KpADH活力的影響，以不添加金屬離子所測得的酶活力為對照（100%），結果見表5。沒有發現具有顯著激活KpADH的氧化和還原活力的金屬離子。Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Li+等離子對 KpADH 的還原和氧化活力的有輕微的激活作用，相對還原和氧化活力分別約為 110%和 120%；Zn2+、Al3+、Cu2+、Ag2+、Fe2+等離子對KpADH的氧化和還原活力都具有嚴重的抑制作用，推測可能是因為 Zn2+、Al3+、Cu2+、Ag2+、Fe2+與參與催化的氨基酸殘基結合從而導致了酶的活力下降。EDTA的添加并沒有使酶活力降低，從另一方面說明KpADH不是金屬離子依賴性酶。蛋白質變性劑SDS的添加導致酶解聚成單體，而單體僅保留有8%的相對活力，說明KpADH的活性依賴于多聚體。吐溫20、DTT、β-巰基乙醇的添加可在一定程度上促進KpADH的氧化和還原活力。其中，吐溫20使酶活力增加最多，可能由于吐溫20作為分散劑增加了難溶底物CPMK在水中的溶解度，從而增大了酶與底物的接觸機率；另外DTT與β-巰基乙醇是還原劑，二者的添加可以防止二硫鍵之間的交聯，這可能是二者添加使得酶活力增大的原因。

表5 金屬離子及添加劑對KpADH的還原酶和氧化酶活力的影響Table 5 Effects of metal ions and additives on the reducing and oxidizing activities of KpADH

2.7 有機溶劑對KpADH活力的影響

生物催化反應的底物大部分都是不溶于水或難溶于水的，在催化反應中需要添加助溶劑，以增加酶與底物接觸的機會，降低傳質阻力。生物催化反應要求助溶劑具有較好的生物相容性、對酶的毒性小、對底物的溶解性高。因此考察了常用有機溶劑如甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃、丙酮對酶活力的影響，CPMK在這5種有機溶劑中的溶解度能達到500 mmol/L，而且甲醇、乙醇和異丙醇也可作為催化反應的輔底物。由圖5（a）可知，對于KpADH的還原活力，在體積分數0.5%的5種溶劑中，酶活力都明顯高于空白對照，而在體積分數1%時，酶活力開始降低，當體積分數大于3%時，酶活力快速降低。由此可見，低體積分數的有機溶劑可以使CPMK更好的分散，從而可以促進酶活力，而隨著有機溶劑體積分數逐漸增加到一定程度，其毒性逐漸增強，酶活力顯著降低。另外，在低體積分數有機溶劑條件下，甲醇是很好的助溶劑，而在稍高的體積分數（如3%）時乙醇則是最好的助溶劑。異丙醇可作為KpADH的輔底物，適量的異丙醇即可促進底物溶解，提高KpADH的催化活力，異丙醇達20%時，KpADH仍保留30%的相對活力，可見KpADH具有良好的異丙醇耐受性。由圖5（a）可知，表觀上丙酮對KpADH沒有毒性，20%的丙酮存在下KpADH仍保留117%的相對活力，這是由于丙酮自身也可作為KpADH的底物而被還原，因此丙酮對KpADH的影響要從氧化活力的變化來判斷。

由圖5（b）可知，隨著乙醇、甲醇、四氫呋喃、丙酮的體積分數增高，酶氧化活力急劇降低，由此可見有機溶劑對KpADH氧化功能的毒性大于還原功能，尤其是四氫呋喃，僅0.5%即可抑制90%的氧化活力。丙酮作為異丙醇氧化的產物，對KpADH活力的影響同樣非常顯著，當丙酮體積分數大于5%時，氧化活力降低至20%。綜上，異丙醇可以作為該生物還原反應優選的助溶劑和輔底物，然而其輔產物丙酮對酶活力存在一定的影響，移除高體積分數的丙酮可以降低抑制作用，促進生物還原反應朝手性雙芳基醇合成的方向進行。

圖5 有機溶劑對KpADH的還原和氧化活力的影響Fig.5 Effect of organic solvents on the reducing and oxidizingactivities of KpADH

2.8 KpADH的底物特異性

為了研究KpADH不對稱還原多種潛手性酮的能力，拓展KpADH的應用范圍，對其底物特異性進行考查。選取一系列不同酮類（芳基酮、雙芳基酮、酮酯和烷基二酮）和醇類底物，考察KpADH對這些底物的氧化和還原活力，結果見表6。對于芳基酮類底物，KpADH對CPMK和苯乙酮均表現出較高的還原活力（100%和56.4%），這類底物位阻大，在水中溶解度低，與羰基還原酶的天然底物性質相差較大，對此類底物有高的催化活性的酶較少。對比二苯甲酮，芐基苯乙酮和3，4-二氯二苯甲酮發現，隨著空間位阻的進一步增大，KpADH的催化活性逐漸降低。 對于 2，3-戊二酮、2，4-戊二酮、2，3-己二酮、3，4-己二酮和 2，5-己二酮等二酮類底物，KpADH更易于還原2，4-戊二酮（74.6%相對活力）。KpADH對酮酯類底物的活力較高，對2-氧-4-苯基丁酸乙酯和乙酰乙酸乙酯的還原活力可以達到CPMK的24倍左右。對于氧化反應的底物特異性，除了2，3-丁二醇外，相對活力均小于10%。KpADH氧化2，3-丁二醇的活力是氧化異丙醇活力的3.6倍，表明2，3-丁二醇可作為用于輔因子再生的潛在輔底物。

表6 KpADH的底物特異性Table 6 Substrate specificity of KpADH towards various prochiral ketones

2.9 利用KpADH不對稱還原制備（R）-CPMA

由于KpADH的氧化和還原活力的最適pH有所差異，合適的反應緩沖液對于KpADH催化的生物還原反應非常重要。因此考察利用KpADH在不同pH（pH 7.0，8.0和9.0）條件下催化反應的效果。反應相同時間后，終止反應，液相色譜分析發現KpADH在pH 8.0的緩沖液中轉化率最高（＞99%），此時KpADH的相對還原活力和氧化活力分別為初始活力的43%和72%。所以選擇pH 8.0的緩沖液研究重組菌全細胞催化還原CPMK。

進一步研究KpADH在制備雙芳基甲醇中的效果。在10 mL反應體系中，利用重組菌E.coli BL21/pET28a-kpadh全細胞對100 mmol/L的CPMK進行不對稱還原，反應進程見圖6。在10 h內，CPMK轉化率達到99.8%，經分離純化后產物（R）-CPMA的摩爾得率為88.7%，ee值為82%。據報道[16]，利用來源于Kluyveromyces marxianus的羰基還原酶KmCR催化還原50 mmol/L CPMK，反應12 h后，轉化率不到20%，產物（R）-CPMA的ee值僅為23.4%；利用來源于畢赤酵母GS115的羰基還原酶PasCR催化還原一系列二芳香基甲酮類化合物（10 mmol/L），轉化率最高僅為90%，且ee值較低[17]。盡管雙芳基甲酮類底物的位阻較大，KpADH仍然表現出較高的催化活性，為手性催化合成（R）-CPMA奠定了重要基礎。

圖6 重組菌E.coli BL21/pET28a-kpadh水相中不對稱催化還原CPMK的反應進程曲線Fig.6 Time course of asymmetric reduction of CPMK by E.coli BL21/pET28a-kpadh in aqueous system

3 結 語

采用基因組數據挖掘的策略，從Kluyveromyces polysporus中發現了具有還原雙芳基酮活力的醇脫氫酶KpADH基因，并成功地在大腸桿菌中實現可溶性表達。KpADH屬于短鏈脫氫酶家族，具有保守的催化三聯體和輔酶結合域。KpADH可利用異丙醇為輔底物，原位再生輔酶NADPH。底物特異性研究發現，KpADH對酮酯類底物和2，3-丁二醇有更高的活力，分別是對CPMK和異丙醇活力的24倍和3.6倍左右。動力學參數研究表明，該酶更適合發揮其還原功能。KpADH氧化活力的最適pH 9.5，還原活力的最適pH 5.5，全細胞催化反應的最適pH 8.0。在水相中能夠不對稱催化還原100 mmol/L CPMK，轉化率達到99.8%，摩爾得率為88.7%，產物（R）-CPMA的ee值達到82%，是迄今為止不對稱還原雙芳基酮類底物效果較出色的一種新酶。本研究對高效制備光學純CPMA具有一定的指導意義，為進一步利用其合成光學純手性雙芳基醇，我們正在開展KpADH立體選擇性的分子改造。

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