薰衣草產(chǎn)酚酸內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)物初步鑒定

熊天真， 謝詩語， 薛亞娟， 白 蓉， 馮佳婷， 管政兵， 廖祥儒， 蔡宇杰

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

植物內(nèi)生真菌是指在生活史的某一段時(shí)期或全部階段生活于健康植物各組織和器官內(nèi)部，不引起被感染的宿主植物組織明顯癥狀改變的真菌[1]。植物內(nèi)生菌具有多種作用[2]，內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)具有較為穩(wěn)定的生存空間，不易受到環(huán)境條件的影響，可以在植物體內(nèi)獨(dú)立的分裂繁殖和傳遞，使之成為生物防治中具有潛力的微生物農(nóng)藥、抗菌劑[3]、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而被加以利用[4]。內(nèi)生菌能夠與宿主相互作用，產(chǎn)生具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[5]。李昆太等人從南方紅豆杉中分離出一株能夠產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，為解決紫杉醇生產(chǎn)帶來了新的思路[6]。因此對(duì)植物內(nèi)生菌進(jìn)行開發(fā)來生產(chǎn)一些天然產(chǎn)物具有重要的意義[7]。

酚酸類化合物是指苯環(huán)上有若干個(gè)酚羥基的一類化合物，在植物中分布廣泛，具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)代謝、抵御病害入侵等多方面的功效，并且大多具有確切的藥理活性和藥用價(jià)值。研究表明，酚酸類化合物不僅具有顯著的抗氧化[8-9]、抗自由基、抗菌[10]消炎以及預(yù)防心血管疾病的作用，而且具有抗癌[11]、抗炎癥[12]和血小板凝聚[13]等功能。目前對(duì)植物提取物中總酚酸測(cè)定的研究較多[14-17]，但是對(duì)植物內(nèi)生菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物總酚酸含量測(cè)定的研究還很欠缺。因此，作者對(duì)薰衣草內(nèi)生真菌進(jìn)行篩選分離，并對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，能夠?qū)χ参飪?nèi)生真菌的進(jìn)一步開發(fā)提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 于春季在江蘇省無錫市采集的薰衣草及本實(shí)驗(yàn)室種植的同品種薰衣草進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 篩菌培養(yǎng)基：PDA瓊脂培養(yǎng)基，添加氨芐青霉素，終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。種子培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基。固態(tài)培養(yǎng)基：大米渣15 g（粒度 1～2 mm），5%葡萄糖 0.75 g，水 15 mL，pH 值自然，121℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薰衣草各組織的表面消毒 分別取野外采集和人工種植的薰衣草各組織，用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干表面的水分，用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇浸泡3 min，無菌水沖洗4次，然后用3%的次氯酸鈉浸泡2 min，用無菌水沖洗4次，以最后一次沖洗液涂平板，在30℃條件下置于培養(yǎng)箱，檢查表面消毒是否徹底。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離與純化 取表面消毒過的薰衣草各組織，分別放入滅過菌的研缽中，加入少量的無菌水，對(duì)其各組織進(jìn)行研磨。取上清液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于加有氨芐青霉素的PDA瓊脂平板上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d，待平板上長(zhǎng)出菌落。用平板劃線的方法反復(fù)接種平板，直到分離出單一的典型菌落。

1.2.3 內(nèi)生真菌的固態(tài)發(fā)酵 于三角瓶中加入種子培養(yǎng)基，滅菌。無菌條件下將純化的菌種轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，置于30℃的搖床上，200r/min搖瓶培養(yǎng)3～5 d。待形成一定濃度的菌體小球后，將菌體轉(zhuǎn)入滅過菌的固態(tài)培養(yǎng)基中，攪拌均勻，然后置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，獲得各菌株的固態(tài)發(fā)酵物。

1.2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容到刻度，得到1 mg/mL的迷迭香酸對(duì)照品溶液。

1.2.5 樣品溶液的制備 精密稱取發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基5 g，加70%乙醇50 mL，于50℃的水浴鍋中振蕩提取12 h，抽濾定容提取液。取5 g滅過菌的固態(tài)培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，作為對(duì)照。

1.2.6 化學(xué)反應(yīng)溶液的制備 精密吸取待測(cè)溶液0.5 mL，加無水乙醇至2.5 mL。分別加入0.3%十二烷基硫酸鈉溶液 1 mL、0.6%三氯化鐵 0.25 mL，0.9%鐵氰化鉀0.22 mL，搖勻，暗處放置5 min。再加入0.1 mol/L鹽酸溶液6 mL，搖勻，暗處放置20 min。

1.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按照含量測(cè)定方法，連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%，表明所采用測(cè)定方法的精密度良好。

1.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按照含量測(cè)定方法，分別在 0，20，40，60，80 min 測(cè)定，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.05%，表明所采用的方法在80 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

1.2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批發(fā)酵的固態(tài)培養(yǎng)基，按照樣品溶液的制備方法制成樣品5份，按照含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%，表明所采用測(cè)定方法的重復(fù)性較好。

1.2.10 液相檢測(cè)方法 色譜柱：LaChrom C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 和 B：分別是乙腈和甲酸溶液（0.1%）；流量：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.11 質(zhì)譜檢測(cè)方法 電離方式：采用負(fù)離子；毛細(xì)管電壓 3.5 kV，錐孔電壓 30 V，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度300℃，脫溶劑氣流速300 L/h，碰撞能量6 eV，檢測(cè)電壓1 700 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 薰衣草內(nèi)生真菌分離結(jié)果

從人工種植和野生采集的薰衣草各組織中分別分離得到18和23株內(nèi)生真菌。對(duì)所篩選的菌株在組織中的分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，從根部篩選出的菌株數(shù)相對(duì)較多，從莖和葉中篩出的菌株數(shù)比較接近，從花中篩選出的菌株數(shù)最少，內(nèi)生菌群在各組織中的分布可能存在數(shù)量上的差異性，這種差異性可能與各組織所接觸的環(huán)境有關(guān)[18]。對(duì)比人工種植的薰衣草與野生的薰衣草中篩選出的菌株數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)野生薰衣草中的內(nèi)生菌群較為豐富，可能與野外的環(huán)境較為復(fù)雜有關(guān)[19]。

表1 薰衣草內(nèi)生真菌各組織分布Table 1 Endophytic fungioflavender distribution organizations

2.2 產(chǎn)酚酸菌株的篩選及初步鑒定

為了探究菌株的產(chǎn)酚酸情況，對(duì)各菌株的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物提取后進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。結(jié)果顯示，從野生薰衣草中篩選菌株M1的發(fā)酵提取物明顯地顯現(xiàn)藍(lán)色，見圖1（b）。說明了M1為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酚酸的菌株。對(duì)M1菌株形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌落長(zhǎng)出白色的菌絲，并且菌絲表面有凝集的小液滴，見圖1（a）。通過18S rRNA測(cè)序和BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其高度同源的基本為曲霉屬，見圖2。所以判斷其為曲霉屬。

圖1 菌株M1形態(tài)及菌株M1化學(xué)反應(yīng)溶液Fig.1 Morphology of M1 and chemical reaction solution of M1

圖2 菌株M1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of M1

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品及M1固態(tài)發(fā)酵提取物，按照上述化學(xué)反應(yīng)方法進(jìn)行處理，然后在200～900 nm范圍內(nèi)測(cè)定吸光度，兩種溶液的光譜吸收?qǐng)D譜基本一致，在720 nm處有最大吸收，因此選擇720 nm為測(cè)量吸光度的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品和M1發(fā)酵提取液波長(zhǎng)掃描Fig.3 Rosemary acid standard and M1 fermentation extract wavelength scanning

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液 （質(zhì)量濃度為1 mg/mL）1、2、2.5、3、4 mL 定容到 5 mL， 分別配置成0.2，0.4，0.5，0.6，0.8 mg/mL 的迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述質(zhì)量濃度測(cè)定方法，以顯色劑為空白，720 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，迷迭香酸對(duì)照品的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為y=0.241 2x-0.008 6，R2=0.998 9，迷迭香酸質(zhì)量濃度在0.2～1mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

圖4 線性關(guān)系考察Fig.4 Linear relationship investigation

2.5 內(nèi)生真菌M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定及加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批樣品5份，每份約1 g，精密加入約5 mg迷迭香酸對(duì)照品，按照1.2.5的方法制備樣品，然后利用化學(xué)反應(yīng)的方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，按照分光光度法，進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，計(jì)算回收率，見表2。

取M1菌株固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基5 g，按照含量測(cè)定方法制備提取液。分別吸取0.5 mL提取液，按照上述化學(xué)反應(yīng)方法顯色后測(cè)定吸光度，利用工作曲線計(jì)算出總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。可以看出3次測(cè)得的總酚酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.938 mg/g，RSD值為0.615%，在允許的誤差范圍內(nèi)，見表3。作者以迷迭香酸為對(duì)照品，對(duì)M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物總酚酸進(jìn)行了質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，該方法靈敏、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recoverie

表3 M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定Table 3 M1 solid-state fermentation product total phenolic acid Determination

2.6 內(nèi)生真菌M1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物初步分析

按照上述高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖5。提取液在280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)下的成分很可能是含有苯環(huán)的酚酸類物質(zhì)[20]。圖中有較強(qiáng)信號(hào)的兩種成分的保留時(shí)間分別為10.61、16.83min，現(xiàn)對(duì)這兩種物質(zhì)進(jìn)行分析。

200～600 nm波長(zhǎng)掃描見圖6，保留時(shí)間10.61 min出峰的物質(zhì)在310 nm左右存在最大的吸收波長(zhǎng)，且此物質(zhì)在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)的液相中有比較強(qiáng)的信號(hào)，那么這種物質(zhì)可能是含有共軛雙鍵的多酚類物質(zhì)，同時(shí)在MS圖譜中還存在相對(duì)豐度較高的325.0的碎片峰。從圖7[M+H]-質(zhì)譜圖可知，相對(duì)分子質(zhì)量為326。此外，存在281.0的碎片峰，推測(cè)為[M+H-COOH]+碎片，說明化合物具有一個(gè)羧基。那么這種物質(zhì)很可能是酚酸類的物質(zhì)。

圖5 M1固態(tài)發(fā)酵提取液高效液相色譜圖及總離子流圖Fig.5 HPLC figure of M1 solid-state fermentation extract and total ion flow diagram

圖6 發(fā)酵提取物10.61 min處的波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.6 Wavelength scanning of fermentation extracts at 10.61 min

圖7 發(fā)酵提取物10.61 min處離子峰質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig.7 MS results（right） of fermentation extracts at 10.61 min

200～600nm波長(zhǎng)掃描見圖8，保留時(shí)間16.83min出峰的物質(zhì)在243、286 nm左右存在最大的吸收波長(zhǎng)，此物質(zhì)可能為含有苯環(huán)的物質(zhì)[21]。從圖9[M+H]-質(zhì)譜圖可知，相對(duì)分子質(zhì)量為398。那么這種物質(zhì)同樣可能是酚酸類物質(zhì)。

圖8 發(fā)酵提取物16.83 min處的波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.8 Wavelength scanning of fermentation extracts at 16.83 min

圖9 發(fā)酵提取物16.83 min處離子峰質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig.9 MS results（right） of fermentation extracts at 16.83 min

3 結(jié) 語

植物內(nèi)生菌是生產(chǎn)天然產(chǎn)物的一個(gè)龐大的資源[22]，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然產(chǎn)物較傳統(tǒng)的植物提取有來源穩(wěn)定以及產(chǎn)量大的優(yōu)勢(shì)[23]。對(duì)內(nèi)生菌株進(jìn)行合理地開發(fā)，利用有著巨大的價(jià)值[24-25]，然而尋找到合適的菌株生產(chǎn)出對(duì)人類有作用的天然產(chǎn)物還需要大量的研究工作。

本研究顯示薰衣草各組織中存在著豐富的內(nèi)生真菌。野外的環(huán)境復(fù)雜多變，而人工種植的薰衣草處在溫度與濕度相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中。同一植株不同的組織中內(nèi)生真菌的數(shù)量存在著一定的差別。對(duì)各菌株的固態(tài)發(fā)酵物進(jìn)行提取，通過化學(xué)反應(yīng)的方法篩選出一株產(chǎn)酚酸物質(zhì)的菌株。然后對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定以及對(duì)所產(chǎn)酚酸物質(zhì)進(jìn)行初步的分析。然而對(duì)于酚酸物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和作用還有待于進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]JIA Li，CHEN Shuying，ZHAI Yonggong，et al.Recent advances in studies on endophytes and their associated bioactive products[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2007，38（11）：1750-1754.（in Chinese）

[2]HUA Yongli，OUYANG Shaoling，CHEN Meilan，et al.Advances of medical endophyte fungi studies[J].World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine Materia Medica，2008，10（4）：105-111.（in Chinese）

[3]LAURENT C，CARRIE WATERMAN，WAI S M，et al.Screening mangrove endophytic fungi for antimalarial natural products[J].Marine Drugs，2013，11（12）：5036-5050.

[4]CHEN Yitao，WANG Weijian.Recent advances on the plant endophyte[J].Progress in Modern Biomedicine，2009，9（16）：3169-3172.（in Chinese）

[5]ZHANG Xiaorui.Research advances in endophytes and their developmental application[J].Progress in Modern Biomedicine，2007，7（11）：1747-1750.（in Chinese）

[6]LI Kuntai，PENG Weifu，ZHOU Jia，et al.Isolation and identification of a paclitaxel-producing endophyte from taxus chinensis var.mairei[J].Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，2013，35（1）：184-188.（in Chinese）

[7]MONICA L，CHAVEZG，SYLVAIN G，et al.Production profilesofphenolicsfrom fungal tannic acid biodegradation in submerged and solid-state fermentation[J].Process Biochemistry，2014，49（4）：541-546.

[8]YOU Xin.Property of nature antioxidacts plants ferulic extracts and their bioactivities on human health[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（7）：673-677.（in Chinese）

[9]RICEEVANS C，MILLER N，PAGANGA G，et al.Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids[J].Free Radical Blology and Medicine，1996，20（7）：933-956.

[10]ALMUDENA G，CAROLINA C，EVA M，et al.Antimicrobial phenolic extracts able to inhibit lactic acid bacteria growth and wine malolactic fermentation[J].Food Control，2012，28（2）：212-219.

[11]THANASET S，SOMPRASONG K，SUWATCHAI M，et al.Phenolic acid composition and anticancer activity against human cancer cell lines of the commercially available fermentation products of houttuynia cordata[J].Scienceasia，2014，40（6）：420-427.

[12]MUSTAFA K，MOUNA A，MOHD R，et al.Ellagic acid，phenolic acids，and flavonoids in malaysian honey extracts demonstrate in vitro anti-inflammatory activity[J].Nutrition Research，2010，30（9）：650-659.

[13]TOMAS J，CHRISTOPHER D，KENNETH J，et al.Prasugrel achieves greater inhibition of platelet aggregation and a lower rate of non-responders compared with clopidogrel in aspirin-treated patients with stable coronary artery disease[J].European Heart Journal，2006，27（10）：1166-1173.

[14]YIN Hai，QIN Cuiling，DU Jiang.Content determination of tatal phenolic acid in soil notoginseng[J].Journal of Medicine and Pharmacy of Chinese Minorities，2012，18（8）：56-57.（in Chinese）

[15]WEI Xu，RAN Xiaoku，LI Weide，et al.Study on content determination of total phenolic Acids in extract of yacon leaves[J].Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine，2015，42（4）：811-814.（in Chinese）

[16]YANG Jie，QI Jin，YU Boyang.Determination of total triterpenoids and total phenolic acids in Prunellae spica collected from different places[J].Strait Pharmaceutical Journal，2015，27（8）：29-31.（in Chinese）

[17]HAN T，HU Y，ZHOU S Y，et al.Correlation between the genetic diversity and variation of total phenolic acids contents in fructus xanthii from different populations in China[J].Biomedical Chromatography，2008，22（5）：478-486.

[18]ZHOU Renchao，HUANG Juan，LI Zeen，et al.Diversity and tissue distribution of fungal endophytes in alpinia officinarum：an important south-China medicinal plant[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2014，39（16）：3023-3029.（in Chinese）

[19]XU Yajun.Research progress on pesources diversity of plant endophytes[J].Guangdong Agricultural Sciences，2011，24：149-152.（in Chinese）

[20]ZHANG Lianghua，DU Qizhen.Preparative purification of nobiletin by high-speed countercurrent chromatography[J].Food Science and Technology，2009，34（1）：156-158.（in Chinese）

[21]WANG Yogwei，SHEN Jiangzeng，CAI Yujie，et al.Research of the extraction and separation on the pigment of fusarium sp JN158[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（1）：62-68.（in Chinese）

[22]Amal H.Aly，Abdes samad Debbab，Julia Kjer，et al.Fungal endophytes from higher plants：a prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products[J].Fungal Diversity，2010，41：1-16.

[23]TAN R X，ZOU W X.Endophytes：a rich source of functional metabolites[J].Natural Product Reports，2001，18：448-459.

[24]YUE Cuicui，SHEN Jianzeng，CAI Yujie，et al.Optimization of fermentation conditions for cordycepin by cordyceps militaris JN168[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（2）：135-141.（in Chinese）

[25]LI Y C，TAO W Y，CHENG L.Paclitaxel production using co-culture of taxus suspension cells and paclitaxel-producing endophytic fungi in a co-bioreactor[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83（2）：233-239.