微反應器在酶催化合成哌啶甲酸中的研究

張 瑞， 曹 遜， 應晗笑， 劉澤蒙， 陳可泉

（南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816）

哌啶甲酸（Pipecolic acid，簡稱PA）是一種剛性環狀非蛋白質氨基酸，可以作為多種化合物合成庫中的多功能骨架[1]。哌啶甲酸或其衍生物可以廣泛用作許多手性藥物和生物活性物質的合成中間體[2]，如抗癌藥物雷帕霉素、局麻藥物布比卡因、新一代抗生素山卓霉素、抗HIV藥物斑莢素以及抗抑郁藥物哌苯甲醇等[3]。由于哌啶甲酸及其衍生物獨特的生物性能和重要的利用價值[4]，其合成制備引起了國內外越來越多的研究者的關注[5]。

目前，哌啶甲酸的合成方法主要有化學不對稱合成、光催化合成以及生物催化合成三種方法[6-8]。其中化學合成法步驟比較繁瑣，且過程中會產生一些對環境有毒害的副產物[9]。光催化合成對催化條件和反應器的要求比較苛刻，反應過程難以控制[10]。酶法合成相比非生物催化劑具有高效性、專一性等特點，使得生物合成法相比其他方法更加環保、高效[11]。

微流控技術是在微尺寸的條件下對復雜流體進行控制、操作和檢測的新興技術[12-14]。相比于在搖瓶或其他反應器[15]，流體在微納尺度下，流體間的傳質、傳熱[16]和反應過程變得高效、易控[17]，極大提高了反應的可控性[18]。利用這一優勢，微流控技術已逐漸應用于生物催化中[19-21]。Kundu等在微通道中用酶催化ε-己內酰胺合成聚己內酯，快速合成了大分子聚己內酯[22]。Kanno等在PDMS微通道中用β糖苷酶水解PNPGal，比試管中進行的反應速率加快了5倍[23]。Heider等用組合式微反應器合成小分子藥物阿利吉侖，達到41 g/L的高產量[24]。

作者采用賴氨酸環化脫氨酶（Lysine cyclodeaminase，簡稱 LCD）催化 L-賴氨酸生成 L-哌啶甲酸[25]，見圖1。在催化過程中底物進入酶活性中心較慢，采用自制PDMS微芯片作為反應器強化傳質，提高反應速率。

圖1 L-賴氨酸經LCD制備L-哌啶甲酸工藝Fig.1 Conversion of L-lysine to L-pipecolic acid by LCD

1 材料與方法

1.1 材料與設備

聚二甲基硅氧烷 （PDMS）聚合物前體及固化劑：購于蘇州文灝科技有限公司；L-賴氨酸：購于國藥集團化學試劑有限公司；L-高脯氨酸：購于阿拉丁；NaCl、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等：購于南京晚晴化玻有限公司。

IKA CVC 3000真空壓力泵進行PDMS脫氣，GZX-9240 MBE數顯鼓風干燥箱進行PDMS的固化，LSP02-1B雙通道注射泵用于微芯片反應，Alltech Series 1500高效液相色譜用于組分檢測。

1.2 賴氨酸環化脫氨酶的培養方法

LB液體培養基包含蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，一定濃度的氨芐抗生素。種子培養方法是先將含有pipA基因的E.coli工程菌株接種于5 mL的LB液體培養基中，加入10 μL的氨芐抗生素。置于37℃搖床，轉速200r/min過夜培養。將種子液用于發酵培養，在500 mL的搖瓶中接種1 mL上述種子液于100 mL的LB液體培養基中，加入200μL 的氨芐抗生素培養 2.5～3 h，在 OD600值達到0.6時加入IPTG，于30℃搖床中誘導表達6 h。

1.3 賴氨酸環化脫氨酶粗酶液制取

將誘導后的發酵液在4℃、5 000 r/min離心5 min收集菌體。加入40 mL、pH 7.0 PBS緩沖液進行重懸菌體洗滌，再以相同條件離心。洗滌兩次后，將菌體重懸于1/10體積的pH 7.0 PBS緩沖液超聲破碎，超聲破碎功率150 W、時間20 min、時間間隔（工作時間∶間歇時間）2∶2（s/s）。 超聲破碎結束后的渾濁液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，即獲得賴氨酸環化脫氨酶粗酶液。

1.4 Bradford考馬斯亮藍法測定蛋白質質量濃度

取兩支干凈的試管，一支加入PBS緩沖液1 mL及Bradford 4 mL，作為空白組。另一支加入稀釋到合適濃度的酶液1 mL及Bradford 4 mL，混勻并室溫靜置5 min，用紫外分光光度計測定樣品在595 nm下的吸光度值，得到樣品中的蛋白質質量濃度。

1.5 L-賴氨酸和L-哌啶甲酸測定

使用高效液相色譜進行含量測定。色譜柱為C18 分析柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）。 流動相 A 為7 mL/L三氟乙酸和5 mmol/L七氟丁酸的水溶液，流動相B為乙腈。進樣體積10 μL，柱溫30℃，用蒸發光散射檢測器檢測。檢測器溫度115℃，使用自動空氣發生器作為氣源，空氣流速3 L/min。

1.6 微芯片制作

微流控芯片的結構見圖2a。制作PDMS芯片的模具由蘇州文灝芯片科技有限公司制作。本次制作的 “S”型通道總長度為31.2 cm，尺寸為200～400 μm，通道深寬比為 1∶1。

硅片模具上的光刻膠易脫落，因此使用甲基硅氧烷對硅片模具進行表面修飾。將硅片模具放入玻璃揮發缸中，滴入甲基硅氧烷2～3滴，使其揮發修飾3 min。

將PDMS聚合物前體和固化劑按質量比10∶1混合后充分攪拌，置于自制的小型密閉容器中，使用真空泵抽氣。利用狹小空間實現快速脫氣，除去混合物中的氣泡，這個過程需要20～30 min，比常用的脫氣裝置縮短了大量時間。脫氣完成后將其小心澆注在硅片模具上，于80℃烘箱靜置20 min。整個過程需要大約1 h。待PDMS固化后將其小心剝離，豎直打孔后，再與另一塊平整的PDMS貼合，于60℃烘箱靜置3 h完成鍵合。

1.7 搖管中進行賴氨酸環化脫氨酶的催化

向磷酸鹽緩沖液中加入賴氨酸，使其質量濃度為10 g/L，再加入粗酶液至蛋白質質量濃度1 g/L和一定量的NAD+與Fe2+，用乙酸調節體系pH到實驗所需，配制成賴氨酸環化脫氨酶催化反應體系。

向10 mL搖管中加入反應液，放置在恒溫振蕩搖床中，轉速250 r/min進行催化反應。

1.8 在微芯片中進行賴氨酸環化脫氨酶的催化

反應體系與1.7所述相同。用注射器吸取反應液，排出注射器前端空氣，然后固定在注射泵上。用硅膠導管連接注射器、微芯片和反應液收集管。通過調節注射泵的注射速度控制反應液流速，向微芯片中注入反應液進行反應。用電子控溫板控制微芯片的溫度。反應流程示意圖見圖2（b）。通過注射泵的“推-拉”進行反應液在微通道中的循環反應。

圖2 “S”型通道形狀以及反應流程Fig.2 S-shape channel and the reaction process

2 結果與討論

2.1 賴氨酸環化脫氨酶的催化特性

為研究賴氨酸環化脫氨酶的催化性質，首先在搖管中對影響賴氨酸環化脫氨酶的催化活力的幾個重要因素進行了研究。影響賴氨酸環化脫氨酶催化反應的主要條件有底物濃度、pH、輔酶NAD+添加和Fe2+等。作者分別對其進行了研究，結果見圖3。其中圖3（a）是不同底物濃度得到的產量曲線，圖3（b）、圖 3（c）和圖 3（d）為不同催化條件下反應 72 h后測得的產量。

圖3 賴氨酸環化脫氨酶的催化特性Fig.3 Characteristic of lysine cyclodeaminase

從圖3（a）可以看出，初始賴氨酸質量濃度最佳條件是12 g/L。賴氨酸質量濃度過低時不易得到產物積累，而賴氨酸質量濃度太高會對酶催化產生底物抑制作用。如圖3（b）所示，pH高于6.5時，能得到產物積累，其中pH為7是最佳催化條件。pH低于6時由于酶易失活，酶催化不能進行。賴氨酸環化脫氨酶作用時候會結合NAD+作為輔因子。不同于細胞內本身代謝就會產生游離的NAD+，游離酶所在的體系中需要添加一定的NAD+，作者對此進行了實驗，發現0.3 g/L是最佳NAD+添加量，同時發現體系中加入0.5 g/L的Fe2+會較多的提升哌啶甲酸產量，而過多的Fe2+會抑制賴氨酸環化脫氨酶的活性，見圖 3（c）和圖 3（d）。 因此，LCD 酶催化賴氨酸合成哌啶甲酸的搖管最佳反應條件為底物質量濃度 12 g/L，初始 pH 為 7，NAD+添加 0.3 g/L，Fe2+添加0.5 g/L。反應約66 h結束，L-哌啶甲酸產量達到2.2 g/L。

2.2 微芯片各條件對于賴氨酸環化脫氨酶催化速率的影響

2.2.1 微通道尺寸對哌啶甲酸產量的影響 微通道尺寸是影響流體反應的一個重要因素。制作了通道尺寸為 200、300、400、700、1 000 μm 的微芯片，并分別用其進行了賴氨酸環化脫氨酶催化反應。催化實驗反應時間6 h，反應液流速40 μL/min，通道長度31.2 cm，數據見圖4。

圖4 微通道尺寸對哌啶甲酸產量的影響Fig.4 Effect of microchannel size on the yield of PA

由于微通道的尺寸直接決定了反應液流體的性質，因此微通道的尺寸會對酶的催化速率產生重要的影響。當微通道的尺寸縮小到一定程度時，流體中的界面效應會發生明顯增大的現象，各組分中的分子由布朗運動而產生的傳質效果也顯著增強，使酶分子與賴氨酸更容易接觸，促進催化反應的進行。從圖4可以發現，尺寸為1 000 μm的通道內酶催化速率慢，當微通道尺寸縮小后，催化速率顯著加快。當微通道尺寸減小到400 μm以內，尺寸效應變得不再那么明顯。尺寸200μm的通道內的催化速率較300 μm和400 μm的通道稍高一些。反應6 h后產量達到0.20 g/L，比搖管中對照反應所得增加了19.9%。

2.2.2 微通道長度對哌啶甲酸產量的影響 微通道的長度是指構成通道的幾何圖形的總長度，本次實驗所設計的微通道長度通過AutoCAD來進行準確測定，總長為31.2 cm。作者研究了微通道長度對哌啶甲酸產量的影響，利用不同長度的200μm尺寸的PDMS微通道進行酶催化反應。催化實驗反應時間6 h，反應液流速40 μL/min，產量見圖5。

圖5 微通道長度對哌啶甲酸產量的影響Fig.5 Effect of microchannel length on the yield of PA

本次實驗設置了4個微通道長度，分別是31.2、62.4、93.6、124.8 cm， 實驗中使用多個通道串聯以增加微通道長度。由圖5可以發現微通道越長，微通道對于酶的催化反應的作用越為明顯。微通道長度決定了反應液在微通道里面的滯留時間，微通道的延長使酶與底物結合的機會變大。由圖5可以得出長度124.8 cm的微通道為最適條件，此條件下催化反應進行6 h后，得到了0.24 g/L的產物，產量比搖管中的反應增加了40.3%。

2.2.3 微芯片中反應液流速對哌啶甲酸產量的影響 在微芯片反應中，反應液流速也是一個對酶催化效率產生重要影響的條件。在一定尺寸、形狀的容器內，流體流速是影響各組分傳質速率的最大因素，流速越快，流體間的傳質速率也會越快。在本次實驗，反應液流速還決定了反應液循環反應過程中進入微通道的次數。由于PDMS微芯片的耐壓能力有限，因此不能無限制的增加流速，否則會因為高流速帶來的過高壓力破壞微通道內部已鍵合的結構，導致微芯片中的流體發生泄漏的現象。作者研究了微芯片中反應液流速對哌啶甲酸產量的影響，進行了20～100 μL/min 5個不同流速下的酶催化反應，結果見圖6。本次實驗使用尺寸200μm的PDMS微芯片 ，反應時間6 h，通道長度31.2 cm。

圖6 反應液流速對哌啶甲酸產量的影響Fig.6 Impact of current speed on the yield of PA

隨著反應液流速的增加，酶催化速率明顯提升。流體流速的增加使其中各組分傳質更快，酶和底物有更多機會結合。考慮到PDMS芯片的耐壓能力，本次實驗將最高流速設置為100 μL/min。當流速為100 μL/min時，反應6 h得到的產量是0.24 g/L，比搖管中反應得到的產量多42.1%。

2.3 酶在微芯片與搖管中催化效率的對比

經過對賴氨酸環化脫氨酶催化條件和微芯片中反應條件的研究，用優化后的條件分別在搖管和微芯片中進行了酶催化反應。本次實驗采用尺寸200μm，長度 124.8 cm 的微通道，用 100 μL/min 的流速進行反應，每隔6小時取樣進行反應物賴氨酸和產物哌啶甲酸質量濃度的測定，結果見圖7。其中4條曲線分別代表各個時刻微芯片和搖管中的賴氨酸和哌啶甲酸含量的變化趨勢。

圖7 微芯片和搖管中的反應過程Fig.7 Whole reaction in microchip and shaking tube

在微芯片中進行的酶催化反應，賴氨酸消耗速率和哌啶甲酸生產速率都快于搖管中的反應。在反應約44 h時，微芯片中的反應到達平衡狀態，此時產物質量濃度為2.22 g/L，底物賴氨酸也不再消耗。搖管中進行的反應在66 h時達到平衡，哌啶甲酸的產量為2.22 g/L，與微芯片中酶催化所得的產量一致。實驗結果表明，在微芯片中的酶催化反應比搖管提前22 h完成，整體縮短了1/3的反應時間。

3 結語

作者設計了一個簡單的“S”型微芯片，用自制裝置實現快速脫氣完成PDMS固化來制作PDMS微芯片，用于加速賴氨酸環化脫氨酶催化L-賴氨酸產生L-哌啶甲酸。賴氨酸環化脫氨酶催化速率較慢，作者對pH、溫度及輔因子添加等催化條件進行了一定優化，并著重于探索如何使用微芯片加速酶的催化。最終使用尺寸為200μm，通道長度為124.8 cm的微芯片，反應液流速設置為100 μL/min，反應44 h后達到平衡。相比搖管中反應66 h反應平衡，縮短了1/3的反應時間。

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