海藻不同方法提取物體外抗病毒活性研究*

陳亞喬，侯 林，崔清華，劉相文，袁 琦，田景振山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355

海藻是海產藻類的統稱，為馬尾藻科植物海蒿子Sargassumpallidum(Turn.)C.Ag或羊棲菜Sargassum fusiforme(Harv.)Setch的干燥藻體，性苦、寒、咸，具有消痰，軟堅散結，利水消腫的功效[1]。相關研究表明[2-6]，海藻具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化以及免疫調節等作用。海藻提取物有抑制單純皰疹病毒1型(HSV-1)和柯薩奇病毒B3(COXB3)的作用，本研究在文獻研究的基礎上，增加對呼吸道合胞病毒(RSV)、柯薩奇病毒(COXB5)、腸道病毒71型(EV71)抗病毒活性研究，以進一步了解海藻的抗病毒譜，現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥品 海藻藥材(購買于濟南建聯中藥店，經山東中醫藥大學徐凌川教授鑒定為馬尾藻科植物海蒿子的干燥藻體)；利巴韋林注射液(山東魯抗辰欣藥業有限公司，批號：1410206811)；阿昔洛韋注射液(亞寶藥業制藥有限公司，批號：15062005)。

1.2 宿主細胞及病毒毒種 RSV、HSV-Ⅰ、COXB5、EV71由山東省醫學科學院基礎醫學研究所提供；人喉癌上皮細胞(Hep2)、橫紋肌瘤細胞(RD)由山東省醫學科學院基礎醫學研究所提供，由山東中醫藥大學B201泰山學者工作室保存。

1.3 主要試劑 1640細胞培養液(美國HyClone公司，批號：AAJ207653)，含 10%新生牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素，過濾除菌，分裝置4℃備用；新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：141013)；PBS磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司，批號：AAK2-8442)；EDTA-0.25%胰酶(美國Gibco 公司，批號：1737903)；4，5- 二甲基噻唑 -2，5-二苯基四唑溴化物(MTT，Sigma公司)；乙醇、丙酮均為分析純。

1.4 儀器 HF90型CO2恒溫培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；CKX-31型倒置顯微鏡(Olympus公司)；HFsafe-1200TE型生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)；DW-86L286型-80℃冰箱(海爾公司產品)；Spectra Max M5型酶標儀(Molecular Device)。

1.5 方法

1.5.1 供試品溶液的制備

1.5.1.1 水回流提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱取40目粉末10.0 g，加入100 mL蒸餾水，回流提取2小時，濾掉藥渣，取濾液，用離心機3 000 r/min離心15分鐘。取上清液抽濾，濃縮至20 mL，水浴蒸干，然后轉至減壓干燥機完全干燥得干浸膏，用5%二甲基亞砜(DMSO)配成濃度為0.01 g/mL的溶液，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，存于1.5 mL EP管中，即為海藻水提物供試品溶液。

1.5.1.2 75%乙醇回流提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱取60目粉末10.0 g，加入100mL 75%乙醇，之后處理步驟同“1.5.1.1”項下方法，即得海藻醇提物供試品溶液。

1.5.1.3 75%乙醇超聲提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱取60目粉末10.0 g，加入100 mL 75%乙醇，常溫下超聲提取30分鐘，之后處理步驟同“1.5.1.1”項下方法，即得海藻醇超聲供試品溶液。

1.5.1.4 丙酮冷浸提取 將海藻原藥材粉碎，烘干至恒重，稱取60目粉末10.0 g，加入100 mL丙酮,密封避光冷浸處理7天，濾掉藥渣，取濾液，用離心機3 000 r/min離心15分鐘。之后步驟同“1.5.1.1”項下方法，即得海藻丙酮供試品溶液。

1.5.2 病毒毒力的測定 將對數生長期的細胞消化并調整濃度為 1×105個 /mL，每孔 100 μL接種于96孔板，24小時后長成單層，棄培養液，依次加入經10倍系列稀釋的待測病毒液100 μL，每濃度重復4孔，同時設細胞對照。37℃、5%CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡下觀察24小時，各孔加5 mg/mL MTT 10 μL，37℃、5%CO2培養箱中培養 4小時后，吸棄染液，加DMSO 100 μL，室溫脫色l0分鐘，震蕩6分鐘，酶標儀在490 nm波長下測定OD值。根據Reed-Muench公式計算病毒液的半數感染濃度(TCID50)。

細胞存活率=各組OD值/正常細胞OD值×100%

細胞比距=(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病率)×100%

TCID50=Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對數)

1.5.3 待測藥物的細胞毒作用 將對數生長期的細胞消化并調整濃度為1×105個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，24小時后長成單層，棄培養液，待測藥物用1640維持液按2倍比稀釋10個濃度梯度，依次接種于己經長成單層的細胞96孔板中，每濃度3個復孔，并設空白對照孔及細胞對照孔；37℃、5%CO2培養箱中培養，24小時后觀察細胞病變程度，找到藥物的最大無毒濃度(TC0)。MTT染色，用酶標儀在490 nm波長測定OD值，應用Reed-Muench公式計算藥物半數中毒濃度(TC50)及TC0，C為供試品初始濃度。

TC50=[Antilog(log高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距)]×C

1.5.4 海藻提取物體外抗病毒實驗方法 將1×105個/mL對數生長期的細胞每孔100 μL接種于96孔板，24小時后長成單層，棄培養液，分別設藥物組(100 μL 藥液 +100 μL 病毒液)、細胞對照組(200μL維持液)、病毒對照組 (100μL維持液+100 μL 病毒液)、空白對照組(無細胞，100 μL 藥液+100 μL病毒液)，藥物組將藥物從最大無毒濃度開始2倍比系列稀釋11個濃度，每個濃度重復3組，按每孔100 μL依次加入到96孔板中，隨后加入含100個TCID50的病毒液100 μL，混合均勻。37℃、5%CO2培養箱培養，待病毒對照組細胞出現90%及以上病變時采用CPE法記錄藥物抑毒情況，隨后MTT法測定每孔OD值，應用Reed-Muench公式計算藥物半數有效濃度EC50及治療指數(TI)，C為供試品初始濃度。

EC50=[Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

治療指數(TI)=半數毒性濃度(TC50)/半數有效濃度(EC50)

2 結果

一般認為TI值≥2，證明藥物有抗病毒活性，TI值≥4，其抗病毒成分有研究價值。本研究結果表明，海藻4種方法提取物對RSV有不同程度的抑制作用，其中水提物抗RSV活性最高，其TI值為413.00，甚至略高于陽性對照藥利巴韋林；乙醇回流提取物也有較好的抗RSV病毒作用，TI值為11.63；乙醇超聲物和丙酮冷浸物抗RSV活性較弱，TI值分別為3.23和3.78。

有文獻報道[7]海藻有抗HSV-1的活性。本研究結果表明，海藻4種提取物均有抗HSV病毒活性，其中水提物的治療指數為310.83，略低于陽性對照藥阿昔洛韋，抗病毒活性較強；其他3種提取物的 TI 值分別為 28.84、4.20、8.06，4 種提取物均有一定的研究價值。

海藻水提、乙醇回流提取、乙醇超聲提取3種方法提取物的抗COXB5活性均較弱，乙醇超聲提取物活性稍強，TI值為19.97。

本研究結果表明，海藻水提物具有較強的抗EV71活性，治療指數為176.07，其活性優于陽性藥利巴韋林，另外3種提取物無抗EV71活性，見表 1—6。

表1 4種病毒的TCID50

表2 待測藥物的細胞毒作用TC50 mg/mL

表3 海藻體外抗RSV實驗結果

表4 海藻體外抗HSV-1實驗結果

表5 海藻體外抗COXB5實驗結果

表6 海藻體外抗EV71實驗結果

3 討論

本實驗考察了海藻對4種病毒的抗病毒效果，結果表明，海藻水提物對實驗所用4種病毒均有良好的抑制作用。海藻的主要化學成分有糖類、酚類、蛋白質、脂類、萜類、黃酮等[8]，本實驗水提物采取加熱回流提取的方式，其中所含化學成分以糖類居多，有實驗表明[9]海藻多糖具有抗HSV-1和COXB3的作用，亦可調節小鼠的免疫功能[10-11]。

本實驗對海藻提取物進行了抗病毒活性的初步篩選，為建立海藻抗病毒譜提供依據，進一步研究的主要任務是找出其主要抗病毒作用的物質基礎及是否與其他成分相互作用以達到抗病毒效果并確定其抗病毒的作用機制。

海洋是人類的天然寶庫，海藻作為海洋天然產物中的一大類，因為其較好的生物多樣性而占據優勢，而且海藻藥理活性豐富，具有很好的研究價值。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：295.

[2]許福泉，郭贛林，郭雷.大葉海藻化學成分及藥理活性研究進展[J].淮海工學院學報：自然科學版，2011，20(4)：90-92.

[3]郭立民.中藥海藻海蒿子Sargassum pallidum(Turn.)C.Ag.的抗腫瘤活性成分研究[D].青島：中國海洋大學，2006.

[4]王長振，叢建波，先宏，等.海藻硫酸多糖的分離純化及其抗腫瘤作用研究[J].解放軍藥學學報，2010，26(4)：283-286.

[5]孫抗，林江，張婷，等.海藻多糖抗腫瘤機制研究綜述[J].廣西中醫學院學報，2012，15(2)：103-105.

[6]牛榮麗，范曉，韓麗君.海藻甲醇提取物免疫調節作用的初步研究[J].中國免疫學雜志，2003，19(10)：669-671.

[7]陳紅艷.紅海藻Bostrychia montagnei中硫酸半乳聚糖體外對HSV復制的抑制作用[J].國外醫藥：植物藥分冊，2002，17(3)：118.

[8]侯林，孟琳，張曉平，等.海藻化學成分及藥理作用研究進展[J].中國保健營養，2013，7(7)：91-92.

[9]張穎，岑穎洲，黃日明，等.南海七種海藻多糖的抗病毒活性初步研究[J].病毒學報，2006，22(4)：282-285.

[10]魏文青，叢建波，先宏，等.海藻硫酸多糖對小鼠免疫功能的調節作用[J].中國新藥雜志，2001，10(9)：670-675.

[11]高淑清，單保恩，趙澤貞，等.四種常見海藻水溶性提取液的免疫調節活性[J].癌變·畸變·突變，2004，16(1)：36-38.