黃芪總苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)損傷足細(xì)胞的保護(hù)作用*

宋元春，賽依帕，高 霞，羅 璇

甘肅省人民醫(yī)院兒科，甘肅 蘭州 730000

黃芪總苷(total astragalus glycosides，AST)是中藥黃芪有效提取成分之一，已有研究[1-4]表明黃芪總苷具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、消炎鎮(zhèn)痛、減輕心腦組織缺血再灌注損傷等多種藥理作用。

足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，具有抵抗腎小球內(nèi)壓力、合成基底膜完整的各種成分和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，能維持腎小球毛細(xì)血管袢的空間結(jié)構(gòu)及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的功能完整性等功能[5]。足細(xì)胞是參與各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞，其損傷是各種腎臟疾病進(jìn)行性病變的基本特征[6]。

課題組前期研究采用阿霉素(ADR)對(duì)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞進(jìn)行模型構(gòu)建，同時(shí)以黃芪總苷溶液對(duì)ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)黃芪總苷可維持ADR損傷的MPC5足細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境的平衡、改善遷移能力、抑制細(xì)胞骨架重排與破壞及抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)損傷的MPC5足細(xì)胞的保護(hù)作用。但是其保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)同樣采用ADR構(gòu)建體外足細(xì)胞損傷模型并經(jīng)不同濃度的黃芪總苷處理，觀察黃芪總苷對(duì)足細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討黃芪總苷發(fā)揮保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠足細(xì)胞系(mouse podocyte clone 5，MPC5)購(gòu)于美國(guó) CHI Scientific公司；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；鹽酸阿霉素(武漢鑫偉燁化工有限公司，注冊(cè)證號(hào)：H20130186)；黃芪總苷(上海晶都生物技術(shù)有限公司，純度≥98%)；Bax、Bcl-2、GAPDH、MT1、Nephrin 抗體及二抗(英國(guó) Abcam 公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 足細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的足細(xì)胞復(fù)蘇后，置于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%左右進(jìn)行傳代，分組處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將MPC5足細(xì)胞分為空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)、ADR 損傷組(ADR 0.5 μmol/L)、低濃度黃芪總苷治療組(ADR 0.5 μmol/L+黃芪總苷50 μg/mL)、中濃度黃芪總苷治療組(ADR 0.5 μmol/L+黃芪總苷100μg/mL)及高濃度黃芪總苷治療組(ADR 0.5μmol/L+黃芪總苷200μg/mL)。各組分別處理24小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，每孔60 μg上樣，隨后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1～2小時(shí)，按1∶1 000比例加入相應(yīng)兔抗小鼠多克隆抗體 Bcl-2、Bax、P53、MT1 及 Nephrin，4℃孵育24小時(shí)，用TBST洗1次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫孵育2小時(shí)，TBST洗膜3次，5 min/ 次，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光法及凝膠成像儀進(jìn)行曝光，采用quantity one軟件測(cè)定蛋白灰度。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)MMP-2和MMP-9 具體步驟嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪總苷對(duì)ADR誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞MMPs蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 ADR可顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白質(zhì)表達(dá)水平(P＜0.05)；低、中、高濃度黃芪總苷均可上調(diào)ADR損傷組MMP-2和MMP-9蛋白質(zhì)表達(dá)水平(P＜0.05)，見表1。

表1 各組足細(xì)胞MMP-2、MMP-9相對(duì)表達(dá)水平(±s) ng/mL

表1 各組足細(xì)胞MMP-2、MMP-9相對(duì)表達(dá)水平(±s) ng/mL

注：＊表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；△表示與ADR損傷組比較，P＜0.05

組別 M M P-2 M M P-9空白對(duì)照組 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 A D R損傷組 0.4 4±0.0 5＊ 0.3 6±0.0 3＊低濃度黃芪總苷組 0.5 6±0.0 4＊Δ 0.5 2±0.0 2＊Δ中濃度黃芪總苷組 0.7 7±0.0 5＊Δ 0.8 0±0.0 3＊Δ高濃度黃芪總苷組 0.7 8±0.0 7＊Δ 0.7 3±0.0 3＊Δ

2.2 黃芪總苷對(duì)ADR誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞MT1、Nephrin及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組相比，ADR可顯著上調(diào)P53、Bax的表達(dá)水平(P＜0.05)，下調(diào) Bcl-2、MT1、Nephrin 蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)；與ADR損傷組相比，低濃度黃芪總苷組MPC5足細(xì)胞Bcl-2及MT1蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)，而Bax、p53及Nephrin表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)；與ADR損傷組比較，中、高濃度黃芪總苷干預(yù)的足細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)量明顯下降，Bcl-2、MT1表達(dá)量有所升高，中濃度黃芪總苷干預(yù)的足細(xì)胞內(nèi)Nephrin表達(dá)量有所上調(diào)，中、高濃度黃芪總苷干預(yù)的足細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)量均有所降低(P＜0.05)，見表 2，圖 1。

表2 各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量(±s)

表2 各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量(±s)

注：＊表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；△表示與ADR損傷組比較，P＜0.05

組別 B a x B c l-2 M T 1 N e p h r i n p 5 3空白對(duì)照組 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 A D R損傷組 1.4 0±0.0 9＊ 0.5 1±0.0 3＊ 0.4 0±0.0 6＊ 0.6 2±0.0 1＊ 2.3 9±0.2 9＊低濃度黃芪總苷組 1.4 2±0.1 0＊ 0.7 3±0.0 4＊Δ 0.6 0±0.1 3＊Δ 0.6 5±0.0 5＊ 2.3 0±0.1 6＊中濃度黃芪總苷組 1.1 7±0.1 8 Δ 0.8±0.0 9＊Δ 1.0 5±0.1 8 Δ 0.7 2±0.0 5＊Δ 1.1 9±0.1 7 Δ高濃度黃芪總苷組 1.1 8±0.0 8 Δ 1.0 3±0.0 3 Δ 0.8 5±0.1 2 Δ 0.6 2±0.0 1＊ 1.4 8±0.2 4＊Δ

圖1 各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

MMPs是一組同源的鋅、鈣依賴性內(nèi)肽酶，主要分為6大類，MMP-2、MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶/明膠酶類[7]。在生理情況下，足細(xì)胞可分泌Ⅳ型膠原補(bǔ)充到腎小球基底膜上，維持多形性膠質(zhì)母細(xì)胞(GBM)的正常新陳代謝。病理量的MMP-2、MMP-9會(huì)降解Ⅳ型膠原，不利于足細(xì)胞的黏附，繼而破壞GBM的完整性，促使腎間質(zhì)纖維化[8-9]。我們前期研究結(jié)果表明ADR能嚴(yán)重破壞足細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性，還可增加足細(xì)胞遷移性能。這些改變不但可導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失、細(xì)胞表型改變，還可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，并且足細(xì)胞從穩(wěn)定型轉(zhuǎn)為遷移型，最終導(dǎo)致足細(xì)胞脫落，破壞基底膜的完整性[10-11]。有研究[12-13]報(bào)道，ADR 對(duì)足細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)及細(xì)胞損傷可能與MMP-2、MMP-9的異常表達(dá)存在密切關(guān)系。本研究采用ELISA法檢測(cè)了各組MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，ADR可顯著降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，而黃芪總苷可上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平。因此，黃芪總苷對(duì)ADR損傷的足細(xì)胞增殖能力及遷移能力的保護(hù)作用可能與改善MMP-2、MMP-9的異常表達(dá)有關(guān)。

p53可調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，包括細(xì)胞凋亡，生長(zhǎng)抑制及抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，分化和加速DNA修復(fù)等[14-15]。細(xì)胞凋亡途徑目前已公認(rèn)的有3條：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中前兩條凋亡通路均有p53蛋白的參與[16]。ADR誘導(dǎo)損傷足細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，黃芪總苷干預(yù)后p53表達(dá)水平有所下調(diào)，以100 μg/mL效果最佳。黃芪總苷對(duì)ADR誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞的保護(hù)作用極有可能與p53信號(hào)通路有關(guān)。ADR誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯改變，100、200 μg/mL 濃度黃芪總苷對(duì)損傷足細(xì)胞Bax的上調(diào)和Bcl-2下調(diào)有顯著的抵御作用，提示黃芪總苷可能有抑制足細(xì)胞損傷加重及凋亡的作用。Nephrin表達(dá)的變化是足細(xì)胞損傷的主要標(biāo)志物之一。有研究[17]證實(shí)，在阿霉素腎病大鼠模型中，Nephrin表達(dá)下調(diào)是蛋白尿產(chǎn)生的主要機(jī)制。本研究中100 μg/mL濃度黃芪總苷干預(yù)的足細(xì)胞nephrin表達(dá)較模型組上調(diào)。MT-1是足細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白之一，對(duì)評(píng)價(jià)足細(xì)胞的活力和完整性有重要意義，在近端小管的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于遠(yuǎn)端小管和集合管[18]。本研究中MT-1表達(dá)水平在ADR誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞中顯著下調(diào)，而在100 μg/mL濃度的黃芪總苷干預(yù)的足細(xì)胞內(nèi)有所上調(diào)。

綜上所述，黃芪總苷對(duì)ADR損傷的MPC5足細(xì)胞具有保護(hù)作用，這可能與黃芪總苷可以下調(diào)ADR損傷足細(xì)胞Bax、p53蛋白表達(dá)水平并上調(diào)MMP-2、MMP-9、MT1及Nephrin等蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

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