海人酸誘導(dǎo)的顳葉癲癇小鼠慢性期行為學(xué)變化△

鄭捷群 甘桐嘉 孫婷婷 王鵬舉 胡瑩瑩 許 浪

(武漢科技大學(xué)腦與認(rèn)知功能實驗室 武漢 430065)

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在臨床上除了有癲癇癥狀的反復(fù)發(fā)作以外，還常伴有認(rèn)知功能的損傷和情緒改變，而這種改變并不會隨著癲癇發(fā)作的控制而得到改變[1～2]，因此越來越受到臨床工作的重視。其中，顳葉癲癇是很多見的一種治療難度大的癲癇，國內(nèi)顳葉癲癇模型行為學(xué)研究較少見。本實驗旨在通過海人酸構(gòu)建小鼠顳葉癲癇模型觀察其在慢性發(fā)作期的行為改變，為研究顳葉癲癇對認(rèn)知功能和情緒的影響提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品

健康雄性成年小鼠(C57BL/6N)，4～5周齡，體重20～22g，從湖北省疾病預(yù)防控制中心購買。海人酸(購自Sigma公司)，行為學(xué)圖像采集和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)儀器購自上海欣軟公司。

1.2 構(gòu)建模型和動物分組

小鼠腹腔注射海人酸(10mg/kg,1mg/ml)，引發(fā)癲癇急性發(fā)作，按照Racine標(biāo)準(zhǔn)[3]給小鼠抽搐的水平分級，3級及以上為造模成功，為實驗組(未達(dá)到3級的，1h后重復(fù)注射(2mg/kg,1mg/ml)直至發(fā)作達(dá)到3級為止)。注射后持續(xù)觀察5h，對于連續(xù)抽搐保持1h不能自行恢復(fù)的腹腔注射鎮(zhèn)靜劑地西泮(4mg/kg)使其緩解。對照組用0.9%的生理鹽水(10ml/kg)腹腔注射。在相同環(huán)境下飼養(yǎng)2個月后，兩組各選取40只實驗(n=40)。每項行為學(xué)實驗對照組和實驗組各10只小鼠。

1.3 行為學(xué)實驗

1.3.1Morris水迷宮實驗

1.3.1.1定位航行訓(xùn)練

前5d，兩組小鼠逐個從水池的十字分割的四個象限中點處背向池中央放入池中，記錄每只小鼠從四個象限出發(fā)尋找到水中可視平臺的平均時間，計為逃避潛伏時間。

1.3.1.2空間探索實驗

最后一天，移走可視平臺。

用相同的方法將兩組小鼠放入池中，記錄每個小鼠在前5d所在的象限滯留的時間，計為目標(biāo)象限滯留時間。

1.3.2條件恐懼實驗

1.3.2.1聲音聯(lián)系恐懼訓(xùn)練實驗

第1d，小鼠暴露在隔離箱里適應(yīng)120s后，給予聲音刺激30s并在最后兩秒足部電擊(0.7mA)2s，間隔20s，重復(fù)聲音及電刺激循環(huán)10次。

1.3.2.2場景聯(lián)系恐懼記憶實驗

第2d，將小鼠放入第1d實驗的環(huán)境中180s，記錄小鼠在此場景中的僵直時間，計算場景聯(lián)系僵直時間百分比(僵直時間百分比=僵直時間/180s)。

1.3.2.3聲音聯(lián)系恐懼記憶實驗

第3d，用酒精擦洗隔離箱并用泡沫板墊底，將實驗動物放入箱中適應(yīng)120s后給予聲音刺激180s，記錄小鼠受到聲音刺激后的聲音聯(lián)系僵直時間百分比(僵直時間百分比=僵直時間/180s)。

1.3.3曠場實驗

內(nèi)壁黑色的無頂盒子，規(guī)格為72cm×72cm×30cm，盒子底部被圖像采集系統(tǒng)劃分為25個正方形小格，小鼠從正中央的小格放入，開始實驗，記錄5min內(nèi)活動總路程、中央?yún)^(qū)(四周無墻壁的小格)滯留時間、大小便次數(shù)。

1.3.4高架十字實驗

十字迷宮的兩對臂互相垂直交叉擺放，臂長度為28cm，寬度是5cm，閉臂周圍有10cm高的圍墻，每只小鼠被放于開臂和閉臂相交處，小鼠背對閉臂開始實驗，記錄5min內(nèi)小鼠在開臂活動的時間比(在開臂的活動時間比=停留于開臂時間/5min)，小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)比(進(jìn)入開臂次數(shù)比=進(jìn)入兩開臂次數(shù)/進(jìn)入四個臂總次數(shù))，進(jìn)入總次數(shù)(進(jìn)入四個臂總次數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1定位航行訓(xùn)練

兩組的逃避潛伏時間均逐漸減少，顯示兩組小鼠均具備學(xué)習(xí)能力。第1、2d，兩個組的逃避潛伏期無差別；后3d，實驗組小鼠的時間明顯比對照組長，差異極具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1，表1。

圖1 定位航行訓(xùn)練實驗

組別例數(shù)1d2d3d4d5d對照組1054．80±2．6047．70±2．4034．00±2．0029．80±1．8021．80±1．00實驗組1055．60±2．8049．60±2．6141．80±2．4037．20±2．0035．20±1．80

2.1.2空間探索實驗顯示，實驗組的滯留時間為(16.96±0.85)s，明顯短于對照組小鼠的(24.90±1.25)s，差異具有極顯著性，見圖2。

圖2 空間探索實驗

2.2 條件恐懼實驗

2.2.1場景聯(lián)系記憶實驗中，實驗組小鼠僵直時間百分比是(17.50±0.88)%，明顯小于對照組小鼠的僵直時間百分比(60.24±3.01)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 場景聯(lián)系僵直百分比

2.2.2聲音聯(lián)系記憶實驗中，實驗組的僵直時間百分比為(49.01±2.45)%,明顯小于對照組僵直時間百分比(79.57±3.98)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 聲音聯(lián)系僵直百分比

2.3 曠場實驗

實驗組活動路程(39728.464±1986.423)mm顯著長于對照組的活動路程(30164.815±1508.241)mm，差異有顯著性(P<0.01)，見圖5。實驗組中間區(qū)域滯留時間(27.068±1.353)s短于對照組的(34.523±1.726)s，有顯著差異(P<0.01)，見圖6。實驗組大小便次數(shù)(6.125±0.306)次明顯多于對照組的(2.750±0.138)次，有極顯著差異，見圖7。

圖5 礦場活動路程

圖6 中間區(qū)域滯留時間

圖7 大小便次數(shù)

2.4 高架十字實驗

實驗組進(jìn)入開臂的次數(shù)百分比是(32.00±1.60)%，對照組是(30.00±1.5)%，兩者無明顯差異(P>0.05)；實驗組開臂停留時間百分比是(31.00±1.55)%，對照組開臂停留時間百分比是(28.59±1.43)%，兩者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8～9。但實驗組與對照組的進(jìn)入開臂和閉臂的總次數(shù)(25.75±1.29)次、(33.00±1.65)次比較，有極顯著差異(P<0.05)，見圖10。

圖8 開臂活動時間百分比

圖9 開臂進(jìn)入次數(shù)百分比

圖10 開臂閉臂進(jìn)入總次數(shù)

3 討論

動物行為學(xué)實驗?zāi)軌蚩陀^地評估實驗動物模型的行為，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究[4～5]。其中，Morris水迷宮實驗[6～7]大多時候被用來觀察小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示癲癇鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較正常鼠明顯下降，這也與孫欽建[8]、錢若兵[9]等的研究結(jié)果相同。已有研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇患者腦結(jié)構(gòu)磁共振成像中[10～11],腦結(jié)構(gòu)的硬化病變波及海馬旁回，杏仁核等具備認(rèn)知功能部分。KA誘導(dǎo)的癲癇小鼠也出現(xiàn)類似的病理變化，此結(jié)果與臨床患者表現(xiàn)一致，說明海人酸致顳葉癲癇小鼠行為學(xué)變化與顳葉癲癇患者的臨床表現(xiàn)有高度吻合性，這為顳葉癲癇的研究提供了途徑。條件恐懼實驗是對小鼠情緒記憶的測試[12]，通過場景和聲音提示引發(fā)小鼠僵直的表現(xiàn)從而判斷恐懼情緒的出現(xiàn)。結(jié)果顯示，癲癇小鼠的情緒記憶能力明顯減弱，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與顳葉癲癇的腦組織損傷以海馬區(qū)域為主相關(guān)，并且海馬是被認(rèn)為與空間記憶緊密聯(lián)系的[13]，而受損傷的杏仁核在恐懼記憶形成的回路中也占重要地位。該結(jié)果與蔡國恩等[12]的匹魯卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇表現(xiàn)相似。曠場試驗中癲癇小鼠自發(fā)行為增多，探索行為減少，情緒更緊張，可以判定癲癇小鼠的焦慮抑郁狀態(tài)[14～16]更明顯。此結(jié)果在癲癇的戊四氮點燃模型中也有體現(xiàn)[17]。高架十字是用來分析動物焦慮表現(xiàn)的一個重要實驗[18～19]，結(jié)果顯示癲癇鼠開臂進(jìn)入次數(shù)和滯留時間與對照組無差異，只在進(jìn)入兩種臂的總次數(shù)上有所減少。有趣的是，該結(jié)果與前述曠場實驗實驗組焦慮樣行為變化明顯相矛盾，這可能與小鼠所處的環(huán)境不同，產(chǎn)生焦慮緊張的原因不同有關(guān)[20]，這種結(jié)果也可能與癲癇慢性發(fā)作期焦慮情緒的補(bǔ)償機(jī)制導(dǎo)致焦慮有所抑制有關(guān)，因為高架十字實驗環(huán)境中小鼠處于風(fēng)險決策性應(yīng)答狀態(tài)[21]，具體有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，慢性持續(xù)的癲癇狀態(tài)會明顯導(dǎo)致小鼠的行為學(xué)改變，具體表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的降低和焦慮緊張情緒的上升，這對更深入的組織和分子層面的研究有引導(dǎo)意義。

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